1. MỞ ĐẦU . 1

1.1.Đặt vấn đề . 1

1.2.Mục đích và yêu cầu đề tài . 2

1.2.1. Mục đích . 2

1.2.2. Mục tiêu 3

1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu 3

1.3.Đối tượng nghiên cứu . 3

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1. Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay . 4

2.2. Giới thiệu về nấm ký sinh trên côn trùng . 4

2.2.1. Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae. . 5

2.2.2. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm. 9

2.3. Sơ lược về phương thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng 10

2.4. Hoạt tính sinh học . 13

2.5. Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về nấm Metarrhizium anisopliae và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại 17

2.5.1. Nghiên cứu trong nước . 17

2.5.2. Nghiên cứu ngoài nước 17

2.6. Vai trò của protease Pr 1 . 18

2.7. Phương pháp phát hiện gen Pr 1 . 19

2.8. Phản ứng PCR 20

2.8.1. Giới thiệu chung về PCR . 20

2.8.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR . 21

2.8.3. Các ứng dụng của phương pháp PCR 23

2.8.3.1. Sử dụng phương pháp PCR tổng hợp mẫu dò cho các thử nghiệm S1 nuclease . 23

2.8.3.2. Sử dụng PCR để sàng lọc 23

2.8.3.3. Sử dụng PCR cho việc thiết kế nhanh các gen tổng hợp 24

2.8.3.4. Sử dụng PCR trong việc kiểm nghiệm 24

2.8.3.5. Định lượng bằng phương pháp PCR . 25

2.8.3.6. Một số ứng dụng khác của kỹ thuật PCR 26

2.8.4. Những hạn chế của phương pháp PCR 26

2.9. Phương pháp xác định trình tự nucleotide . 27

2.9.1. Nguyên tắc hoá học: phương pháp Maxam và Gilbert 28

2.9.2. Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotid của Sanger 28

3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 30

3.1. Thời gian và địa điểm . 30

3.1.1. Thời gian 30

3.1.2. Địa điểm . 30

3.2. Vật liệu và hoá chất 30

3.2.1. Vật liệu . 30

3.2.1.1. Mẫu thí nghiệm . 30

3.2.1.2. Các primer dùng trong khuếch đại gen và giải trình tự 31

3.2.2. Hoá chất và môi trường 31

3.2.2.1. Các hóa chất dùng để chiết tách DNA từ khối sợi nấm 31

3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di 31

3.2.2.3. Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio - Rad cung cấp) . 32

3.2.2.4. Môi trường 32

3.2.3. Các thiết bị chính 32

3.3.Nội dung nghiên cứu 32

3.4. Phương pháp nghiên cứu 33

3.4.1. Phân lập và tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số sâu hại cây trồng . 33

3.4.1.1. Chuẩn bị môi trường PGA 33

3.4.1.2. Phương pháp tách bào tử . 33

3.4.2. Xác định qui trình PCR phát hiện gen Pr 1 liên quan tới tính độc của nấm Metarrhizium anisopliae . 33

3.4.2.1. Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm . 33

3.4.2.2. Phương pháp ly trích DNA . 34

3.4.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA 34

3.4.2.4. Khuếch đại gen Pr 1-PCR 35

3.4.2.5. Điện di trên gel agarose . 36

3.4.2.6. Đọc kết quả điện di 37

3.4.3. Sử dụng phương pháp giải trình tự để xác định và phát hiện sự sai khác cụ thể trong đa dạng di truyền nấm Metarrhizium anisopliae . 37

3.4.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR 37

3.4.3.2. Lượng DNA thích hợp cho đọc trình tự 38

3.4.3.3. Thành phần của phản ứng đọc trình tự 39

3.4.3.4. Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự 39

3.4.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR 39

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 41

4.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số sâu hại cây trồng 41

4.2. Sử dụng phương pháp PCR phát hiện gen liên quan đến tính độc của nấm Metarrhizium anisopliae, genprotease (Pr 1) . 43

4.2.1. Quy trình ly trích DNA của các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae . 43

4.2.2. Tiến hành phản ứng PCR . 45

4.2.3. Xác định trình tự nucleotide trong đoạn gen gây độc Pr 1 của nấm Metarrhizium anisopliae 47

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 53

5.1. Kết luận 53

5.1.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae 53

5.1.2. Phương pháp ly trích DNA và kỹ thuật PCR . 53

5.1.3. Phương pháp đọc trình tự gen Pr 1 . 53

5.2. Đề nghị . 53

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 56

7. PHỤ LỤC 59