1. MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 2

1.2.Mục đích yêu cầu 3

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Giới thiệu tổng quan về cây cacao 3

2.1.1. Nguồn gốc cây cacao 3

2.1.2. Đặc điểm hình thái 3

2.1.3.Yêu cầu sinh thái 5

2.1.4. Các giống cacao 5

2.1.4. Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài 6

2.2. Qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật 6

2.3. Giới thiệu về kỹ thuật PCR 8

2.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 8

2.3.2. Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 10

2.3.2.1. DNA mẫu 10

2.3.2.2. Taq polymerase 10

2.3.2.3. Primer 11

2.3.2.4. Nhiệt độ bắt cặp 13

2.3.2.5. Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu 14

2.3.2.6. Các thành phần khác 14

2.3.2.7. Số lượng chu kỳ phản ứng PCR 15

2.3.2.8. Thiết bị và dụng cụ trong phản ứng PCR 15

2.3.3. Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết 16

2.3.4. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR 17

2.4. Giới thiệu về phương pháp phân tích trình tự DNA 19

2.5. Giới thiệu về Microsatellite 20

2.5.1. Khái niệm về Microsatellite 20

2.5.2. Các loại Microsatellite 20

2.5.3. Cơ chế hình thành Microsatellite 21

2.5.4. Vai trò của Microsatellite 22

2.5.5. Các phương pháp phát hiện Microsatellite 24

2.5.5.1.Phương pháp lai 24

2.5.5.2.Phương pháp PCR 24

2.5.6.Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer PCR 25

2.5.6.1.Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các loài 27

2.5.6.2.Thiết kế primer microsatellite 28

2.5.7.Ưu, khuyết điểm của phương pháp microsatellite so vớ các phương pháp khác 29

2.5.8. Những ứng dụng của nghiên cứu Microsatellite 30

2.6. Các công trình nghiên cứu có liên quan 31

2.6.1. Kiểm tra tính đồng nhất di truyền của Theobroma cacao bằng Microsatellite marker 31

2.6.2. Nghiên cứu fingerprinting DNA của cacao sử dụng Microsatellite marker 32

3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

3.1. Vật liệu 35

3.1.1. Các giống cacao thí nghiệm 35

3.1.2. Hóa chất thí nghiệm 37

3.1.2.1. Primer 37

3.1.2.2. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA 38

3.1.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR 38

3.1.2.4. Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự 38

3.1.3. Thiết bị thí nghiệm 39

3.2. Phương pháp 39

3.2.1. Đối tượng nghiên cứu 39

3.2.2. Bố trí thí nghiệm 39

3.2.3. Kỹ thuật ly trích DNA 41

3.2.4. Kiểm tra định lượng và định tính DNA 42

3.2.4.1.Định tính DNA bằng phương pháp điện di 42

3.2.4.2.Định lượng DNA bằng quang phổ kế 42

3.2.5. Qui trình phản ứng Microsatellite 42

3.2.5.1.Phản ứng PCR với 1 cặp primer 42

3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer 43

3.2.6.Điện di sản phẩm PCR 45

3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng máy giải trình tự DNA 45

3.2.8.Phương pháp nhận diện bằng phần mềm Cervus 46

3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm Genetix

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50

4.1.Sản phẩm DNA li trích 50

4.2.Sản phẩm PCR 51

4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao 52

4.4.Kết quả nhận diện các mẫu được mã hóa 55

4.5. So sánh dữ liệu microsatellite 58

4.6.Kết quả phân tích multiplex PCR 59

4.7. Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền 61

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

6. PHỤ LỤC 65

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 8