Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục tiêu và yêu cầu 2

1.2.1. Mục tiêu 2

1.2.2. Yêu cầu 2

1.3. Hạn chế của đề tài 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1. Giới thiệu chung về cây điều 4

2.1.1. Nguồn gốc cây điều 4

2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây điều 4

2.1.2.1. Thân và cành cây 4

2.1.2.2. Hệ rễ 4

2.1.2.3. Lá 5

2.1.2.4. Hoa và quả điều 5

2.1.3. Đặc điểm sinh thái của cây điều 6

2.1.3.1. Khí hậu 6

2.1.3.2. Đất đai 7

2.1.3.3. Mật độ trồng 7

2.1.4. Giống điều và các phương pháp nhân giống 7

2.1.4.1. Đặc điểm thực vật học của các giống điều 7

2.1.4.2. Phương pháp nhân giống cây điều 8

2.1.5. Sản xuất điều trên thế giới 8

2.1.6. Sản xuất điều ở Việt Nam 10

2.1.7. Tình hình canh tác cây điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 14

2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 15

2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử 15

2.2.1.1. Chỉ thị hình thái 16

2.2.1.2. Chỉ thị allozyme 16

2.2.1.3. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA 16

2.2.2. Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 17

2.2.3. Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 17

2.2.4. Kỹ thuật STS (Sequence – Tagged Sites) 17

2.2.5. Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) 18

2.2.6. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA 18

2.2.6.1. Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD 19

2.2.6.2. Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD 22

2.2.6.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD 22

2.2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 22

2.2.7. Kỹ thuật AFLP 23

2.2.7.1. Nguyên lý kỹ thuật AFLP 23

2.2.7.2. Các bước của kỹ thuật AFLP 24

2.2.7.3. Những ưu điểm của kỹ thuật AFLP 27

2.2.7.4. Những hạn chế của kỹ thuật AFLP 27

2.2.7.5. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 27

2.2.8. So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 28

2.2.9. Kỹ thuật PCR 28

2.2.9.1. Nguyên lý của kỹ thuật PCR 28

2.2.9.2. Quy trình chuẩn của phản ứng PCR 30

2.2.9.3. Tối ưu hoá phản ứng PCR 31

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.1 Vật liệu 33

3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 33

3.1.1.1. Nguyên liệu 33

3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 33

3.1.2. Hóa chất cần thiết 33

3.1.2.1. Hóa chất dùng cho tách chiết và kiểm tra DNA lá điều 33

3.1.2.2. Hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR – RAPD 35

3.1.2.3. Hóa chất dùng cho kỹ thuật AFLP 35

3.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 36

3.1.3.1.Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho tách chiết và kiểm tra DNA 36

3.1.3.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật PCR – RAPD 36

3.1.3.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật AFLP 37

3.2. Phương pháp nghiên cứu 37

3.2.1. Phần thu thập mẫu 37

3.2.1.1. Phương pháp chọn mẫu 37

3.2.1.2. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 38

3.2.2. Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm 38

3.2.2.1. Phương pháp tách chiết và kiểm tra DNA lá điều 39

3.2.2.2. Kỹ thuật RAPD 40

3.2.2.3. Kỹ thuật AFLP 43

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

4.1. Phần điều tra và thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 48

4.2. Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm 50

4.2.1. Kết quả tách chiết DNA 50

4.2.1.1. Kết quả chung 50

4.2.1.2. Một số vấn đề tách chiết DNA ở lá điều 50

4.2.2. Kết quả thực hiện kỹ thuật RAPD, bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền và nhận diện

một số band có thể là chỉ thị phân tử 52

4.2.2.1. Kết quả thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình của các tác giả nước ngoài 52

4.2.2.2. Kết quả thí nghiệm 2: Giảm số chu kỳ xuống còn 35 chu kỳ và giữ nguyên thành phần hóa chất như thí nghiệm 1 53

4.2.2.3. Kết quả thí nghiệm 3: Tăng số chu kỳ lên 37 chu kỳ và giữ nguyên thành phần hóa chất như thí nghiệm 1 54

4.2.2.4. Kết quả thí nghiệm 4: Thay đổi thành phần hóa chất,thực hiện phản ứng PCR qua 37 chu kỳ 55

4.2.2.5. Kết quả thực hiện kỹ thuật PCR – RAPD 56

4.2.2.6. Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD 61

4.2.2.7. Phân tích kết quả phản ứng PCR – RAPD bằng phần mềm NTSYS 61

4.2.2.8. Đánh giá đa dạng di truyền 62

4.2.2.9. Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 79

4.2.2.10. Hạn chế của kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật PCR – RAPD 71

4.2.3. Kết quả thực hiện kỹ thuật AFLP trên một số mẫu DNA lá điều 72

4.2.3.1. Kết quả cắt giới hạn và gắn adapter 72

4.2.3.2. Kết quả phản ứng nhân bản tiền chọn lọc 72

4.2.3.3. Kết quả thực hiện phản ứng nhân bản chọn lọc 73

4.2.3.4. Phân tích kết quả AFLP trên một số mẫu DNA lá điều 74

4.2.3.5. Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD 78

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79

5.1. Kết luận 79

5.1.1. Phần thu thập mẫu 79

5.1.2. Phần tách chiết DNA 79

5.1.3. Phần kỹ thuật RAPD, đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử 79

5.1.3. Phần kỹ thuật AFLP 80

5.2. Đề nghị 80

5.2.1. Về phương hướng phát triển canh tác cây điều ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 80

5.2.2. Về những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử trên cây điều 81

Tài liệu tham khảo 82

Phụ lục 1: Mẫu phiếu điều tra nông dân.

Phụ lục 2: Danh sách các hộ được khảo sát.

Phụ lục 3: Danh sách các mẫu tách được DNA.

Phụ lục 4: Danh sách các mẫu thực hiện phản ứng PCR – RAPD.

Phụ lục 5: Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết quả PCR – RAPD.

Phụ lục 6: Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết quả AFLP 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45.

Phụ lục 7: Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết quả AFLP 4 mẫu TT1, TT31,CD40, M78