TÓM TẮT

NGUYỄN ĐÌNH TRƯỜNG, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG RT - PCR”.

Hội đồng hướng dẫn:

PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN

Đề tài được tiến hành tại các xã trong huyện Củ Chi, Trảng Bàng, Châu

Thành

Ø Điều tra mức độ nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt, tại các xã trong huyện

Ø Tiến hành lấy mẫu bệnh TSWV tại vùng điều tra và chẩn đoán bằng kỹ thuật

ELISA và RT - PCR tại Trung tâm phân tích Thí Nghiệm, Bộ môn Bảo vệ

Thực vật Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

Nội dung thực hiện:

Ø Điều tra, đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV ngoài đồng bằng sự đánh giá về

hình thái.

Ø Lấy mẫu, tiến hành chẩn đoán bằng phương pháp ELISA và RT - PCR, từ đó

rút ra kết luận về triệu chứng điển hình của TSWV trên cây ớt.

Kết quả đạt được:

Ø Tỷ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra

- Nhuận Đức: 12,1%

- Phước Thạnh: 12,5%

- Lộc Hưng: 0%

Ø Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng

- Lá khảm vàng xanh, cong, héo rũ: 37,5%

- Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn: 57%

- Lá khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ:53%

- Khảm vàng nhạt trên lá và cả rìa lá: 25% Ø Tỷ lệ nhiễm trên trái

- Trái nhiễm: 33%

- Không nhiễm: 67%

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa ii

Cảm tạ . iii

Tóm tắt iv

Danh sách các chữ viết tắt v i

Mục lục v ii

Danh sách các bảng . x i

Danh sách các đồ thị .x i

Danh sách các hình x ii

Danh sách các sơ đồ .x ii

Phần I. Mở Đầu . 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục Đích - Yêu cầu . 1

1.2.1 Mục đích nghiên cứu . 1

1.2.2 Yêu cầu 1

Phần II. Tổng Quan Tài Liệu . 2

2.1 Giới thiệu về cây ớt 2

2.1.1 Sơ lược về cây ớt 2

2.1.2 Nguồn gốc cây ớt 2

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt 2

2.1.3.1 Thân . 2

2.1.3.2 Rễ 2

2.1.3.3 Lá 2

2.1.3.4 Hoa . 3

2.1.3.5 Quả . 3

2.1.3.6 Hạt 3

2.1.4 Giá trị dược liệu của cây ớt . 3

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng của ớt . 4

2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác . 4

2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt 9

2.3.1 Nhiệt độ 9

2.3.2 Ánh sáng 9

2.3.3 Ẩm độ . . 9

2.3.4 Đất và dinh dưỡng 9

2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) 10

2.4.1 Sơ lược nguồn gốc TSWV . 10

2.4.2 Cấu trúc TSWV . 10

2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh . 13

2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV 14

2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt 14

2.8 Con đường lây bệnh và dịch tễ học . 15

2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển . 16

2.10 Khống chế bệnh TSWV . 16

2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV . 18

2.11.1 Phương pháp cây chỉ thị 18

2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận 18

2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống . 18

2.11.2 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 19

2.12 ELISA . 19

2.12.1 Khái niệm về ELISA 19

2.12.2 Phân loại ELISA . 20

2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) . 20

2.12.2.2 ELISA gián tiếp 21

2.12.2.3 Sandwich ELISA 21

2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh 22

2.12.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA 23

2.12.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA 23

2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR . 23

2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR . 23

2.13.2.Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR . 25

2.13.3 Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR 30

2.13.4 Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết 31

2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thước dài hơn . 31

2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thước ngắn hơn 32

2.13.4.3 Không thu được bất kỳ sản phẩm nào . 32

2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu 33

2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau 33

2.14 Phương pháp RT-PCR 33

2.14.1 Phân loại RT - PCR 33

2.14.1.1 Phản ứng RT - PCR một bước . 33

2.14.1.2 Phản ứng RT - PCR hai bước 34

2.14.2 Các phương pháp được thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA 34

2.15 Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV . 35

2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam . 35

2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới 35

Phần III. Vật Liệu và Phương Pháp Nghiên Cứu 36

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 36

3.2 Phương pháp điều tra và lấy mẫu . 36

3.3 Phương pháp lấy mẫu . 36

3.4 Các phương pháp chẩn đoán TSWV 37

3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS - ELISA . 37

3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA . 37

3.4.1.2 Các bước thực hiện 37

3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT - PCR 39

3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad 39

3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di . 40

3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT - PCR . 40

3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT - PCR . 41

3.4.2.5 Phướng pháp đổ gel agarose điện di 43

Phần IV. Kết quả Thảo luận 45

4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA .45

4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra 45

4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt 46

4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng . 47

4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi . . 50

4.2 Kết quả tiến trình RT - PCR 51

4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA . 51

4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer 52

4.2.3 Kết quả tiến trình RT - PCR . . 53

4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR . 54

Phần V. Kết luận và đề nghị . . 60

5.1 Kết luận 60

5.2 Đề nghị 60

Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 61

PHẦN VII. PHỤ LỤC . 64

Phần I

Mở Đầu

1.1 Đặt vấn đề

Cây ớt (Capsicum annum L.) là cây trồng quan

trọng thứ hai (sau cây cà chua) trong các loại cây

vừa như một loại rau, vừa như một loại gia vị.

Ngoài ra trong quả ớt chứa nhiều vitamin như: A,

B, C, D, Caroten và một số chất khoáng khác.

Trồng ớt mang lại hiệu quả kinh tế cao gấp 3-4 lần

so với cây lúa nên những năm gần đây, ở nước ta

cây ớt được trồng với diện tích và sản lượng ngày càng tăng, đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Ớt là mặt hàng xuất khẩu đứng vị trí số 1 trong các loại gia vị. (Trích dẫn luận văn tốt nghiệp Nguyễn Hữu Trúc)

Ngoại thành TP.Hồ Chí Minh có điều kiện tự nhiên và xã hội thuận lợi cho việc

phát triển nhiều chủng loại rau, trong đó cây ớt luôn được chú trọng và được trồng với

diện tích ngày càng tăng. Tuy nhiên, việc phát triển ớt chuyên canh lại là điều kiện cho

nhiều loại mầm bệnh gây hại phát triển mạnh, trong đó bệnh gây ra bởi virus mà gây

hại mạnh nhất là virút gây bệnh đốm héo rũ trên cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus-

TSWV) gây khó khăn cho những vùng chuyên sản xuất ớt hiện nay, ảnh hưởng đến

kinh tế rất lớn. Chính vì lý do đó mà đề tài “Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh

TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn

đoán bằng kỹ thuật RT - PCR” được thực hiện nhằm xác định sớm mầm bệnh, từ đó

có biện pháp ngăn chặn kịp thời và giảm bớt mức thiệt hại do mầm bệnh này gây ra.

1.2 Mục Đích - Yêu cầu

1.2.1 Mục đích nghiên cứu

Thực tập, ứng dụng và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bệnh TSWV trên đối tượng cây ớt ở mức độ phân tử, từ đó có thể đánh giá được hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt tại các địa bàn điều tra.

1.2.2 Yêu cầu

+ Phải đi thực tế tại các địa bàn để điều tra, lấy mẫu ớt.

+ Nắm vững lý thuyết về hai phương pháp dDAS-ELISA cũng như RT - PCR, rồi từ đó mới tiến hành các phương pháp chẩn đoán