NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHưƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR

NGUYỄN ĐÌNH TRƯỜNG

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa ii

Cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Mục lục vii

Danh sách các bảng xi

Danh sách các đồ thị .xi

Danh sách các hình xii

Danh sách các sơ đồ xii

Phần I. Mở Đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục Đích - Yêu cầu 1

1.2.1 Mục đích nghiên cứu .1

1.2.2 Yêu cầu 1

Phần II. Tổng Quan Tài Liệu .2

2.1 Giới thiệu về cây ớt .2

2.1.1 Sơ lược về cây ớt .2

2.1.2 Nguồn gốc cây ớt .2

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt 2

2.1.3.1 Thân .2

2.1.3.2 Rễ .2

2.1.3.3 Lá .2

2.1.3.4 Hoa .3

2.1.3.5 Quả .3

2.1.3.6 Hạt 3

2.1.4 Giá trị dược liệu của cây ớt 3

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng của ớt .4

2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác 4

2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt 9

2.3.1 Nhiệt độ 9

2.3.2 Ánh sáng 9

2.3.3 Ẩm độ 9

2.3.4 Đất và dinh dưỡng .9

2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) .10

2.4.1 Sơ lược nguồn gốc TSWV .10

2.4.2 Cấu trúc TSWV .10

2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh 13

2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV .14

2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt .14

2.8 Con đường lây bệnh và dịch tễ học .15

2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển .16

2.10 Khống chế bệnh TSWV .16

2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV .18

2.11.1 Phương pháp cây chỉ thị 18

2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận 18

2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống .18

2.11.2 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 19

2.12 ELISA 19

2.12.1 Khái niệm về ELISA .19

2.12.2 Phân loại ELISA 20

2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) 20

2.12.2.2 ELISA gián tiếp .21

2.12.2.3 Sandwich ELISA .21

2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh 22

2.12.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA .23

2.12.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA 23

2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 23

2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 23

2.13.2.Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 25

2.13.3 ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR 30

2.13.4 Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết .31

2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thước dài hơn 31

2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thước ngắn hơn .32

2.13.4.3 Không thu được bất kỳ sản phẩm nào 32

2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu 33

2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau .33

2.14 Phương pháp RT-PCR .33

2.14.1 Phân loại RT – PCR .33

2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bước 33

2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bước 34

2.14.2 Các phương pháp được thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA 34

2.15 Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV 35

2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam 35

2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới .35

Phần III. Vật Liệu và Phương Pháp Nghiên Cứu 36

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .36

3.2 Phương pháp điều tra và lấy mẫu 36

3.3 Phương pháp lấy mẫu 36

3.4 Các phương pháp chẩn đoán TSWV .37

3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA .37

3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA .37

3.4.1.2 Các bước thực hiện 37

3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR .39

3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad .39

3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di 40

3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR 40

3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR .41

3.4.2.5 Phướng pháp đổ gel agarose điện di 43

Phần IV. Kết quả Thảo luận .45

4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA .45

4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra .45

4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt .46

4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng 47

4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi .50

4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR .51

4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA .51

4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer .52

4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR 53

4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR .54

Phần V. Kết luận và đề nghị .60

5.1 Kết luận 60

5.2 Đề nghị 60

Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHẦN VII. PHỤ LỤC .64

NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHưƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PC