TÓM TẮT

Lâm Ngọc Hạnh. Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. ”Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT-PCR” đƣợc tiến hành tại huyện Đơn Dƣơng, huyện Đức Trọng và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm, từ tháng

3/2005 đến tháng 8/2005.

Thí nghiệm đƣợc thực hiện gồm 3 nội dung chính.

1. Mẫu đƣợc thu theo triệu chứng bệnh virus, mỗi ruộng 5 mẫu kết hợp với điều tra sơ bộ tình hình bệnh trên cà chua ở 21 thôn và 2 thị trấn thuộc huyện Đơn Dƣơng và Đức Trọng. Từ đó, đánh giá tình hình bệnh virus trên cà chua ở địa bàn nghiên cứu.

2. Xác định tác nhân gây bệnh virus chính trên cà chua (TMV, CMV, TSWV) bằng phƣơng pháp DAS-ELISA sử dụng kháng thể đa dòng. Mẫu đƣợc phân tích là những lá cà chua có triệu chứng bệnh virus. Mỗi mẫu lá đƣợc kiểm tra trên 3 virus để xác định có virus nào trong 3 virus trên nhiễm riêng lẻ hay đồng thời lên mẫu đang nghiên cứu hay không.

3. Mẫu dƣơng tính TMV đƣợc chọn để thực hiện RT-PCR nhằm bƣớc đầu xây dựng quy trình RT-PCR để chẩn đoán TMV. Từ đó, khẳng định lại kết quả ELISA đồng thời sản phẩm thu đƣợc từ RT-PCR sẽ đƣợc dùng cho những nghiên cứu xa hơn.

Kết quả thu đƣợc:

- Điều tra sơ bộ tình hình bệnh ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng cho thấy tại thời điểm nghiên cứu cà chua ở Đức Trọng bị tàn phá nặng nề bởi bệnh virus trong khi cà chua ở Đơn Dƣơng vẫn tốt.

- Kết quả DAS-ELISA cho thấy dịch bệnh virus ở Đức Trọng chủ yếu là do CMV gây ra. TMV có gây bệnh nhƣng ít hơn. TSWV chƣa gây bệnh ở khu vực này vào thời điểm nghiên cứu.

- Bƣớc đầu tìm đƣợc một quy trình RT-PCR tạo ra sản phẩm khá đặc hiệu nhƣng chƣa khẳng định đƣợc đó là sản phẩm khuếch đại từ khuôn mẫu nào.

SUMMARY

This is Lam Ngoc Hanh studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9th,

2005. The thesis entitled “Diagnosing Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA and formulating the RT-PCR process to diagnose Tobacco Mosaic Virus in Viet Nam”. This research was conducted from 3th,

2005 to 8th, 2005 at Don Duong, Duc Trong districts and in the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University.

The objects of this research are as follows:

- Collecting the samples with the virus symptoms, 5 samples per each field and generally investigating the virus infection on tomato in Don Duong and Duc Trong

districts so that the virus disease incidence in Don Duong and Duc Trong districts

can be evaluated.

- Diagnosing pathogens in tomato such as Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA kit using polyclonal antibodies from rabbit. The samples tested are tomato leaves appearing the virus symptoms. Each sample is tested for Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus.

- Samples of Tobacco Mosaic Virus positive are seleted to conduct the RT-PCR. We try to formulate the RT-PCR process used to both diagnose Tobacco Mosaic Virus and confirm DAS-ELISA results.

The results of this research are as follows:

- Through the general investigation on tomato in Don Duong and Duc Trong districts, we find out that tomato in Duc Trong have been severely destroyed by viruses.

- DAS-ELISA result data show that Cucumber Mosaic Virus is the key pathogen creating virus disease epidemic in Duc Trong on 3th, 2005 while Tobacco Mosaic Virus appears mildly and Tomato Spotted Wilt Virus is not found now in these areas.

- Finding out the RT-PCR process that can amplify the pretty specific product but the product has not been confirmed yet.

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG Lời cảm tạ . .. i Tóm tắt . ii Tóm tắt bằng tiếng Anh .. iii Mục lục .. iv Danh sách các chữ viết tắt .. viii Danh sách các bảng, biểu đồ ix Danh sách các hình .. x PHẦN I. MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục đích yêu cầu . 2

1.2.1. Mục đích.. 2

1.2.2. Yêu cầu. 2

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Cà chua .. 3

2.1.1. Sơ lược về cà chua . 3

2.1.2. Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới.. 3

2.1.3. Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt. 4

2.2. Bệnh hại trên cà chua . 4

2.2.1. Sơ lược về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) 6

2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra . 6

2.2.1.2 Phân loại của TSWV . 7

2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế 7

2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV .. 8

2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV.. 8

2.2.1.6 Tính chất của TSWV . 9

2.2.1.7 Vector truyền . 9

vi

2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV. 10

2.2.1.9 Triệu chứng bệnh . 11

2.2.1.10 Khống chế bệnh do TSWV .. 11

Cây kháng . 11

Quản lý TSWV 12

2.2.2. Sơ lược về Tobacco Mosaic Virus (TMV) .. 14

2.2.2.1 Lịch sử của bệnh .. 14

2.2.2.2 Phân loại của TMV . 14

2.2.2.3 Sự phân bố của TMV. 14

2.2.2.4 Ký chủ của TMV . 14

2.2.2.5 Đặc điểm cấu tạo của TMV 14

2.2.2.6 Tính chất của TMV. 16

2.2.2.7 Đặc điểm truyền bệnh .. 17

2.2.2.8 Sự phát sinh phát triển của TMV 17

2.2.2.9 Triệu chứng bệnh do TMV . 17

2.2.2.10 Phòng trừ .. 19

2.2.3. Sơ lược về Cucumber Mosaic Virus (CMV) 19

2.2.3.1 Lịch sử của bệnh do CMV .. 19

2.2.3.2 Phân loại CMV . 20

2.2.3.3 Phạm vi phân bố 21

2.2.3.4 Ký chủ 21

2.2.3.5 Đặc điểm cấu tạo của CMV 21

2.2.3.6 Tính chất lý hóa của CMV. 23

2.2.3.7 Sự truyền bệnh .. 24

2.2.3.8 Điều kiện phát triển của bệnh 24

2.2.3.9 Triệu chứng . 25

2.2.3.10 Phòng trừ 25

2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật . 26

2.3.1. Phương pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị . 26

vii

2.3.2. Phương pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu . 26

2.3.3. Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng học .. 26

2.3.4. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kháng huyết thanh 27

2.3.4.1 Phương pháp Direct ELISA 28

2.3.4.2 Phương pháp Indirect ELISA .. 28

2.3.4.3 Phương pháp Sanwich ELISA. . 28

Direct Sanwich ELISA hay DAS-ELISA

(Double antibody sandwich-ELISA) .. 28

Indirect Sanwich ELISA 28

2.3.4.4 Tissue blot immunoassay (TIBA) 28

2.3.4.5 Quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor . 28

2.3.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào trình tự đoạn DNA. . 29

2.3.5.1 Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphirm) 29

2.3.5.2 Phương pháp PCR hay RT-PCR đối với RNA . 29

2.3.5.3 Các kỹ thuật liên quan đến PCR khác . 29

2.3.5.4 Phương pháp sử dụng probe đánh dấu. 29

2.3.5.5 Array .. 29

2.4. Phương pháp DAS-ELISA và phương pháp RT-PCR .. 30

2.4.1. Phương pháp DAS-ELISA . 30

2.4.2. Phương pháp RT-PCR . 30

2.5. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về bệnh do CMV,

TMV và TSWV gây ra trong thời gian gần đây.. 32

2.5.1. Ở nước ngoài . 32

2.5.2. Ở Việt Nam 33

PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 34

3.1.1. Thời gian thực hiện đề tài .. 34

3.1.2. Địa điểm thực hiện đề tài 34.

viii

3.2. Vật liệu .. 34

3.2.1. Dụng cụ 34

3.2.2. Hóa chất . 34

3.3. Phương pháp 35

3.3.1. Điều tra và lấy mẫu .. 35

3.3.2. Phương pháp nghiên cứu. 35

3.3.2.1 Chẩn đoán bằng DAS-ELISA 35

3.3.2.2 Chẩn đoán bằng RT-PCR 36

Ly trích RNA .. 36

Phản ứng reverse transcriptase (RT) tạo cDNA 37

Phản ứng PCR . 38

3.3.2.3 Phân tích sản phẩm PCR.. 44

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

4.1. Phản ứng ELISA 46

4.1.1. Kết quả ELISA . 46

4.1.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với

các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV .. 47

4.1.3. Tỷ lệ bệnh theo tuổi cây thể hiện trong số mẫu điều tra . 48

4.1.4. Tỷ lệ bệnh theo địa điểm thể hiện trong số mẫu điều tra 49

4.1.5. Tỷ lệ bệnh theo giống cà thể hiện trong số mẫu điều tra .. 51

4.1.6. Triệu chứng thực tế trong các mẫu thí nghiệm 52

4.1.7. Tỷ lệ bệnh theo loại triệu chứng quan sát được .. 53

4.2. Kết quả của phản ứng RT-PCR . 57

Kết quả RT-PCR sử dụng cặp primer 1 .. 57

Kết quả RT-PCR sử dụng 2 cặp primer 2 và 3. 62

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .. 70

5.1. Kết luận . 70

5.2. Đề nghị .. 71

PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

ix

PHỤ LỤC 1 Thành phần các dung dịch trong phản ứng ELISA . 76

PHỤ LỤC 2 Thành phần các chất trong kit tổng hợp iScriptTM. .. 77

PHỤ LỤC 3 Thành phần các hóa chất trong phản ứng PCR . 78

PHỤ LỤC 4 Hình chụp các đĩa chứa mẫu phân tích bằng ELISA . 79

PHỤ LỤC 5 Bảng câu hỏi điều tra .. 80

PHỤ LỤC 6 Danh sách các trình tự tương đồng với TMV dòng ở Trung Quốc

dùng để thiết kế primer. . 81

PHẦN I. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cà chua (Solanum lycopersicum) được trồng rộng rãi trên thế giới từ thế kỷ thứ 19 cho đến nay ([url=http://web.uk.ask.com/redir?u=http%3a%2f%2ftm.uk.ask.com]Ask Jeeves Web Search). Đây là cây trồng thích hợp với hoạt động trồng trọt bán thời gian và qui mô nhỏ. Cà chua có giá trị thương mại khá cao. Mỗi năm, nước Mỹ thu về hàng tỷ đô la từ thị trường xuất khẩu cà chua. Cà chua là loại rau cao cấp rất được ưa chuộng vì nó có giá trị dinh dưỡng cao. Các nhà khoa học Nga còn cho biết: quả cà chua có thể dùng làm vắc - xin phòng chống bệnh viêm gan siêu vi A, B, bệnh AIDS và bệnh viêm não. Nhu cầu cà chua luôn luôn lớn và kỹ thuật trồng cà chua lại không quá phức tạp hay khó khăn, không tốn nhiều trang thiết bị đặc biệt.

Vì những lý do đó mà cà chua thường được trồng xen canh với các cây rau màu khác trên những vùng đất thích hợp. Thế nhưng, cà chua có thể bị ảnh hưởng bởi rất nhiều bệnh, bao gồm bệnh do ký sinh (như nấm, vi khuẩn, virus, mycoplasma, tuyến trùng) và bệnh không do ký sinh (như độ ẩm của đất, nhiệt độ, ánh sáng không thích hợp hay bởi sự mất cân bằng dinh dưỡng). Bệnh do virus gây ra là khó khống chế nhất và có thể tạo ra tổn thất rất nặng nề khi bệnh lan ra thành dịch.

Trong 10 năm trở lại đây, bệnh virus thực vật đã lan rộng hơn và xuất hiện nhiều dịch bệnh virus hơn. Ở Việt Nam, bệnh virus trên cà chua cũng xuất hiện ở nhiều nơi trên diện tích lớn. Ví dụ như dịch virus vào tháng 3 năm 2005 ở huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng đã làm cho 27 ha cà chua ở đây thiệt hại gần như 100% (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật tỉnh Lâm Đồng). Do đó, cần phải xác định xu hướng lây lan của virus trên thế giới và tiến hành những hoạt động kiểm dịch ở những nơi cần thiết đồng thời tiến hành những nghiên cứu xa hơn nhằm phục vụ cho việc phòng chống bệnh virus cho cây trồng.

Xuất phát từ tình hình phát triển của cà chua và bệnh virus trên cà chua mà chúng tôi thực hiện đề tài: ”Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum

lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT - PCR”.

1.2. Mục đích yêu cầu

1.2.1 Mục đích

- Chẩn đoán và phát hiện CMV (Cucumber Mosaic Virus), TMV (Tobacco Mosaic Virus) và TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) trong mẫu lá nghi ngờ bệnh virus bằng kỹ thuật DAS - ELISA (double antibody sanwich - enzyme linked immunosorbent assay). Từ đó, đánh giá tình hình bệnh ở khu vực nghiên cứu.

- Bước đầu xây dựng quy trình chẩn đoán TMV bằng RT - PCR.

1.2.2 Yêu cầu

- Xác định tỉ lệ bệnh do các virus TMV, CMV, TSWV gây ra trên đồng ruộng. Từ đó khuyến cáo tác hại và các biện pháp khống chế bệnh do các virus này gây ra.

- Nắm vững nguyên tắc và các bước tiến hành của kỹ thuật ELISA và RT - PCR.