MỤC LỤC

Tên mục Trang

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT . iv

MỤC LỤC . v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT . viii

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ . ix

Phần I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề . 1

1.2 Mục đích và yêu cầu . 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 3

2.1.1 Giới thiệu 3

2.1.2 Lịch sử bệnh 3

2.1.3 Dịch tễ học . 4

2.1.4 Các con đường lây nhiễm 5

2.1.4.1 Sự lây truyền dọc 5

2.1.4.2 Sự lây truyền ngang 6

2.1.5 Triệu chứng lâm sàng . 7

2.1.6 Bệnh tích 8

2.2 Các phương pháp dùng trong chẩn đóan bệnh do virus PRRS gây ra 8

2.2.1. Phân lập virus sống . 8

2.2.2. Phân lập virus hoặc kháng nguyên virus . 9

2.2.3. Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh . 10

2.2.4. Phương pháp RT- PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS . 12

2.3. Phương pháp PCR . 13

2.3.1. Nguyên tắc 13

2.3.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR 13

2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR . 14

2.3.4. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR 15

2.4 Phương pháp RT-PCR . 16

2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR 16

2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược . 16

2.4.3. Các primer trong phiên mã ngược . 18

PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHưƠNG PHÁP . 20

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

3.2. Nội dung nghiên cứu 20

3.3. Vật liệu và hóa chất 20

3.3.1. Mẫu xét nghiệm . 20

3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR . 20

3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA . 21

3.3.4. Vật liệu và hóa chất cho điện di RNA 21

3.3.5. Vật liệu và hóa chất cho RT-PCR . 21

3.3.6. Vật liệu và hóa chất cho điện di sản phẩm RT-PCR . 22

3.4. Thiết bị và dụng cụ . 22

3.5. Các phương pháp 22

3.5.1. Bảo quản dịch nuôi cấy tế bào 22

3.5.2. Chẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh . 23

3.5.3. Tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh theo quy trình

sử dụng TRIzol . 23

3.5.4. Phương pháp điện di RNA trên gel biến tính . 24

3.5.5. Phương pháp RT-PCR trên RNA virus . 25

3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR 27

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 28

4.1. Kết quả RT-PCR trên mẫu chuẩn của PRRSV 28

4.1.1. RT-PCR với Taq beat hot start (Promega) . 28

4.1.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene . 29

4.2. Kết quả RT-PCR trên mẫu RNA ly trích 30

4.2.1. RT-PCR với Taq beat hot start trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng

phương pháp sử dụng TRIzol . 30

4.2.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene trên các mẫu ly trích

từ dịch nuôi cấy tế bào sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit . 31

4.3. Điện di RNA trên mẫu ly trích . 32

4.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer . 33

4.5. RT-PCR sử dụng cặp primer P1, P2 33

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 35

5.1. Kết luận 35

5.2. Đề nghị . 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 36

PHỤ LỤC . x

Phần I. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) là tác nhân chính gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn - PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome). Đây là một bệnh mới, phức tạp. Đặc trưng của bệnh là gây sẩy thai ở giai đoạn cuối, chết thai và thai khô hoặc lợn con sinh ra yếu, bệnh biểu hiện ở hệ hô hấp của lợn con theo mẹ và lợn cai sữa, bệnh còn làm trì hoãn sự động dục và những khó khăn về hô hấp ở lợn.

Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các kiểu chăn nuôi: nuôi nhốt hay thả rong; tập trung hay phân tán, qui mô đàn lớn hay nhỏ và tình trạng sức khoẻ tốt hay xấu. Nguyên nhân lây bệnh phổ biến là do thiếu cách ly hoặc kiểm dịch đối với lợn mua, ở gần đàn mắc bệnh và qui mô đàn lớn.

Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, việc chẩn đoán và phát hiện bệnh sớm là rất quan trọng. Tuy nhiên việc phát hiện theo phương pháp nuôi cấy truyền thống thì lại rất khó khăn và mất nhiều thời gian.

Cho đến những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đã phát triển một cách mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó kỹ thuật PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn. Đây là một kỹ thuật có độ chính xác cao, ít tiêu tốn thời gian và về mặt chi phí thì có thể chấp nhận được.

Nhằm mục đích ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân tử vào công tác chẩn đoán, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Trần Thị Dân, chúng tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”