MỤC LỤC

PHẦN TRANG

Trang tựa

Lời cảm tạ .iii

Tóm tắt . . iv

Mục lục . . v

Danh sách các chữ viết tắt . .v ii

Danh sách các bảng . .v iii

Danh sách các hình và biểu đồ . ix

1. MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu . . 2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

2.1 Sơ lược về khoai tây và bệnh trên khoai tây 3

2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây . 4

2.2.1 Sơ lược về virus PVX (Potato virus X) . . 4

2.2.2 Sơ lược về virus PVY (Potato virus Y) . 5

2.2.3 Sơ lược về virus PLRV (Potato leafroll virus) 6

2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh cây . . 8

2.3.1 Phương pháp chẩn đoán bên ngoài . 8

2.3.2 Phương pháp sinh học . 8

2.3.3 Phương pháp quang phổ . 8

2.3.4 Phương pháp so sánh độ đục của dịch cây 8

2.3.5 Phương pháp chiết quang kép 9

2.3.6 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử . . 9

2.3.7 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) . 9

2.3.7.1 Phương pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich . 10

2.3.7.2 Phương pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) . 10

2.3.8 Phương pháp RT-PCR . 10

2.3.9 Phương pháp giải trình tự gen 11

2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nước về PVX, PVY và PLRV trên khoai tây 12

2.4.1 Nghiên cứu trong nước về virus PVX, PVY và PLRV 12

2.4.2 Nghiên cứu nước ngoài về virus PVX, PVY, PLRV 13

3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

3.2 Vật liệu nghiên cứu 14

3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA phát hiện PVX, PVY và PLRV 14

3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV 15

3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA 15

3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR . 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu . 16

3.3.1 Nội dung nghiên cứu 16

3.3.2 Phương pháp điều tra và lấy mẫu . 16

3.3.3 Phương pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV 17

3.3.3.1 Phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA 17

3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phương pháp RT-PCR 20

3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV . 25

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 27

4.1 Tình hình canh tác khoai tây tại Thành phố Đà Lạt . 27

4.2 Kết quả phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kỹ thuật ELISA . 27

4.2.1 Kết quả kiểm tra ELISA tại các phường 27

4.2.2 Kết quả ELISA theo từng giống 29

4.2.3 Kết quả ELISA theo từng thế hệ . 30

4.2.4 Kết quả ELISA theo tháng tuổi . 30

4.3 Kết quả RT-PCR . 31

4.4 Kết quả giải trình tự . 34

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 3 8

PHỤ LỤC 40

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những nguồn thực phẩm quan trọng nhất của con người (xếp thứ năm trong các loại thực phẩm chính trên thế giới sau lúa mì, gạo, bắp và đại mạch ).

Tuy nhiên trở ngại lớn nhất trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại trong đó bệnh do virus là vô cùng nghiêm trọng. Khoai tây có thể bị nhiễm hơn 30 loại virus khác nhau, phổ biến nhất và nguy hại nhất là các loại virus PVX (Potato virus X), PVY (Potato virus Y) và PLRV (Potato leafroll virus) với các triệu chứng khảm, cuốn, đốm, nhăn nheo và hoại tử trên lá. Sản lượng khoai tây bị thiệt hại nghiêm trọng khi bị tạp nhiễm cùng lúc nhiều loại virus. Năng suất khoai tây có thể giảm tới 80% khi bị nhiễm tổ hợp PVX, PVS và PLRV (Salazar 1982).

Ở nước ta, khoai tây được trồng chủ yếu vào vụ đông ở đồng bằng Sông Hồng,

các tỉnh phía Bắc (sản xuất 85% khoai tây của Việt Nam) và trồng quanh năm ở Đà

Lạt (chiếm 15% sản lượng) với các loại giống chủ yếu như 06 và 07. Mặc dù vậy,

nhận thức của nông dân cũng như những nghiên cứu về bệnh virus và thiệt hại do bệnh

virus trên khoai tây còn rất hạn chế. Do đó việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đưa

ra những biện pháp phòng trừ thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh gây

ra là hết sức cần thiết.

Do đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, đòi

hỏi nhiều dụng cụ và trang thiết bị hiện đại mới thực hiện được. Ngày nay cùng với sự

phát triển nhanh chóng và hỗ trợ đắc lực của công nghệ sinh học đặc biệt là sinh học

phân tử với các kỹ thuật chẩn đoán như ELISA, RT-PCR, Sequencing, đã tạo điều kiện

thuận lợi cho công tác nghiên cứu, chẩn đoán cũng như phòng trừ bệnh virus trên

khoai tây.

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR và giải trình tự”

1.2 Mục đích

- Phát hiện các loại virus (PVX, PVY, PLRV) trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA.

- Phát hiện virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR.

- Giải trình tự đoạn gen có được sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR để xác định nguồn gốc của đoạn gen này.

1.3 Yêu cầu

- Thực hiện phản ứng ELISA để kiểm tra các mẫu thu thập từ năm phường trên địa bàn thành phố Đà Lạt.

- Thực hiện phản ứng RT-PCR với mẫu có kết quả dương tính với virus PLRV.

- Lấy sản phẩm RT-PCR của virus PLRV đi giải trình tự và so sánh với ngân hàng gen