ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO

SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Lời cảm tạ . . . i

Tóm tắt . ii

Tóm tắt bằng tiếng Anh iii

Mục lục . iv

Danh sách các chữ viết tắt . viii

Danh sách các bảng, biểu đồ . ix

Danh sách các hình . x

PHẦN I. MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề . 1

1.2. Mục đích yêu cầu . 2

1.2.1. Mục đích . 2

1.2.2. Yêu cầu . 2

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

2.1. Cà chua . 3

2.1.1. Sơ lược về cà chua . 3

2.1.2. Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới 3

2.1.3. Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt 4

2.2. Bệnh hại trên cà chua . 4

2.2.1. Sơ lược về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) . 6

2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra . 6

2.2.1.2 Phân loại của TSWV . 7

2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế 7

2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV 8

2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV 8

2.2.1.6 Tính chất của TSWV . 9

2.2.1.7 Vector truyền . 9

2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV . 10

2.2.1.9 Triệu chứng bệnh 11

2.2.1.10 Khống chế bệnh do TSWV 11

Cây kháng . 11

Quản lý TSWV . 12

2.2.2. Sơ lược về Tobacco Mosaic Virus (TMV) 14

2.2.2.1 Lịch sử của bệnh . 14

2.2.2.2 Phân loại của TMV . 14

2.2.2.3 Sự phân bố của TMV 14

2.2.2.4 Ký chủ của TMV . 14

2.2.2.5 Đặc điểm cấu tạo của TMV . 14

2.2.2.6 Tính chất của TMV . 16

2.2.2.7 Đặc điểm truyền bệnh . 17

2.2.2.8 Sự phát sinh phát triển của TMV . 17

2.2.2.9 Triệu chứng bệnh do TMV . 17

2.2.2.10 Phòng trừ . 19

2.2.3. Sơ lược về Cucumber Mosaic Virus (CMV) 19

2.2.3.1 Lịch sử của bệnh do CMV . 19

2.2.3.2 Phân loại CMV 20

2.2.3.3 Phạm vi phân bố 21

2.2.3.4 Ký chủ . 21

2.2.3.5 Đặc điểm cấu tạo của CMV . 21

2.2.3.6 Tính chất lý hóa của CMV 23

2.2.3.7 Sự truyền bệnh . 24

2.2.3.8 Điều kiện phát triển của bệnh . 24

2.2.3.9 Triệu chứng 25

2.2.3.10 Phòng trừ 25

2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật . 26

2.3.1. Phương pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị 26

2.3.2. Phương pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu 26

2.3.3. Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng học . 26

2.3.4. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kháng huyết thanh . . 27

2.3.4.1 Phương pháp Direct ELISA. . . 28

2.3.4.2 Phương pháp Indirect ELISA . 28

2.3.4.3 Phương pháp Sanwich ELISA. 28

Direct Sanwich ELISA hay DAS-ELISA

(Double antibody sandwich-ELISA) . 28

Indirect Sanwich ELISA . 28

2.3.4.4 Tissue blot immunoassay (TIBA) . . 28

2.3.4.5 Quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor 28

2.3.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào trình tự đoạn DNA. . 29

2.3.5.1 Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphirm) . . 29

2.3.5.2 Phương pháp PCR hay RT-PCR đối với RNA . 29

2.3.5.3 Các kỹ thuật liên quan đến PCR khác 29

2.3.5.4 Phương pháp sử dụng probe đánh dấu . 29

2.3.5.5 Array 29

2.4. Phương pháp DAS-ELISA và phương pháp RT-PCR 30

2.4.1. Phương pháp DAS-ELISA 30

2.4.2. Phương pháp RT-PCR 30

2.5. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về bệnh do CMV,

TMV và TSWV gây ra trong thời gian gần đây 32

2.5.1. Ở nước ngoài . 32

2.5.2. Ở Việt Nam . . 33

PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . . 34

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện . . 34

3.1.1. Thời gian thực hiện đề tài 34

3.1.2. Địa điểm thực hiện đề tài . . 34.

3.2. Vật liệu 34

3.2.1. Dụng cụ . . 34

3.2.2. Hóa chất 34

3.3. Phương pháp . 35

3.3.1. Điều tra và lấy mẫu . 35

3.3.2. Phương pháp nghiên cứu . 35

3.3.2.1 Chẩn đoán bằng DAS-ELISA . . 35

3.3.2.2 Chẩn đoán bằng RT-PCR . . 36

Ly trích RNA . 36

Phản ứng reverse transcriptase (RT) tạo cDNA . 37

Phản ứng PCR 38

3.3.2.3 Phân tích sản phẩm PCR . 44

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . . 46

4.1. Phản ứng ELISA . 46

4.1.1. Kết quả ELISA . 46

4.1.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với

các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV . 47

4.1.3. Tỷ lệ bệnh theo tuổi cây thể hiện trong số mẫu điều tra . 48

4.1.4. Tỷ lệ bệnh theo địa điểm thể hiện trong số mẫu điều tra . 49

4.1.5. Tỷ lệ bệnh theo giống cà thể hiện trong số mẫu điều tra . 51

4.1.6. Triệu chứng thực tế trong các mẫu thí nghiệm . 52

4.1.7. Tỷ lệ bệnh theo loại triệu chứng quan sát được . 53

4.2. Kết quả của phản ứng RT-PCR 57

Kết quả RT-PCR sử dụng cặp primer 1 57

1 2

Kết quả RT-PCR sử dụng 2 cặp primer 2 và 3 . 62

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 70

5.1. Kết luận . 70

5.2. Đề nghị 71

PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO . . 73

PHỤ LỤC 1 Thành phần các dung dịch trong phản ứng ELISA . 76

PHỤ LỤC 2 Thành phần các chất trong kit tổng hợp iScriptTM. . 77

PHỤ LỤC 3 Thành phần các hóa chất trong phản ứng PCR 78

PHỤ LỤC 4 Hình chụp các đĩa chứa mẫu phân tích bằng ELISA 79

PHỤ LỤC 5 Bảng câu hỏi điều tra 80

PHỤ LỤC 6 Danh sách các trình tự tương đồng với TMV dòng ở Trung Quốc

dùng để thiết kế primer. . 81

PHẦN I. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cà chua (Solanum lycopersicum) được trồng rộng rãi trên thế giới từ thế kỷ thứ 19

cho đến nay (http://web.uk.ask.com/redir?u=http%3a%2f%2ftm.uk.ask.com). Đây là cây

trồng thích hợp với hoạt động trồng trọt bán thời gian và qui mô nhỏ. Cà chua có giá trị

thương mại khá cao. Mỗi năm, nước Mỹ thu về hàng tỷ đô la từ thị trường xuất khẩu cà

chua. Cà chua là loại rau cao cấp rất được ưa chuộng vì nó có giá trị dinh dưỡng cao. Các

nhà khoa học Nga còn cho biết: quả cà chua có thể dùng làm vắc - xin phòng chống bệnh

viêm gan siêu vi A, B, bệnh AIDS và bệnh viêm não. Nhu cầu cà chua luôn luôn lớn và

kỹ thuật trồng cà chua lại không quá phức tạp hay khó khăn, không tốn nhiều trang thiết

bị đặc biệt.

Vì những lý do đó mà cà chua thường được trồng xen canh với các cây rau màu khác trên những vùng đất thích hợp. Thế nhưng, cà chua có thể bị ảnh hưởng bởi rất nhiều bệnh, bao gồm bệnh do ký sinh (như nấm, vi khuẩn, virus, mycoplasma, tuyến trùng) và bệnh không do ký sinh (như độ ẩm của đất, nhiệt độ, ánh sáng không thích hợp hay bởi sự mất cân bằng dinh dưỡng). Bệnh do virus gây ra là khó khống chế nhất và có thể tạo ra tổn thất rất nặng nề khi bệnh lan ra thành dịch.

Trong 10 năm trở lại đây, bệnh virus thực vật đã lan rộng hơn và xuất hiện nhiều

dịch bệnh virus hơn. Ở Việt Nam, bệnh virus trên cà chua cũng xuất hiện ở nhiều nơi trên

diện tích lớn. Ví dụ như dịch virus vào tháng 3 năm 2005 ở huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm

Đồng đã làm cho 27 ha cà chua ở đây thiệt hại gần như 100% (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật

tỉnh Lâm Đồng). Do đó, cần phải xác định xu hướng lây lan của virus trên thế giới và tiến

hành những hoạt động kiểm dịch ở những nơi cần thiết đồng thời tiến hành những nghiên

cứu xa hơn nhằm phục vụ cho việc phòng chống bệnh virus cho cây trồng.

Xuất phát từ tình hình phát triển của cà chua và bệnh virus trên cà chua mà chúng

tôi thực hiện đề tài: ”Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus,

Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT - PCR”.

1.2. Mục đích yêu cầu

1.2.1 Mục đích

- Chẩn đoán và phát hiện CMV (Cucumber Mosaic Virus), TMV (Tobacco Mosaic Virus) và TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) trong mẫu lá nghi ngờ bệnh virus bằng kỹ thuật DAS - ELISA (double antibody sanwich - enzyme linked immunosorbent assay). Từ đó, đánh giá tình hình bệnh ở khu vực nghiên cứu.

- Bước đầu xây dựng quy trình chẩn đoán TMV bằng RT - PCR.

1.2.2 Yêu cầu

- Xác định tỉ lệ bệnh do các virus TMV, CMV, TSWV gây ra trên đồng ruộng. Từ đó khuyến cáo tác hại và các biện pháp khống chế bệnh do các virus này gây ra.

- Nắm vững nguyên tắc và các bước tiến hành của kỹ thuật ELISA và RT - PCR