MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Lời cảm tạ . iii

Summary . vi

Tóm tắt . v

Mục lục vi

Danh sách chữ viết tắt . x

Danh sách bảng xi

Danh sách hình . xii

1. GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Nội dung thực hiện 2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 3

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 4

2.1.3.1 Môi trường nuôi cấy . 4

2.1.3.2 Điều kiện nhiệt độ 4

2.1.3.3 Điều kiện pH 4

2.1.4 Điều kiện phân bố . 4

2.1.5 Độc tố của nấm Beauveria bassiana . 5

2.1.6 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng . 6

2.1.6.1 Sự xâm nhập 6

2.1.6.2 Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết 6

2.1.7 Triệu chứng của côn trùng nhiễm nấm 7

2.1.8 Các chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana . 8

2.2 Tổng quan về ITS - rDNA . 9

2.2.1 Giới thiệu về rDNA và ITS 9

2.2.2 Phân nhóm rDNA 10

2.2.3 Sơ lược lịch sử nghiên cứu rDNA . 11

2.2.4 Sơ đồ vị trí và trình tự các primer dùng trong nghiên cứu rDNA

và vùng ITS 12

2.2.4.1 Vị trí và trình tự primer khuếch đại nu-rDNA 12

2.2.4.2 Vị trí và trình tự primer khuếch đại mt-rDNA 13

2.2.5 Ý nghĩa của ITS - rDNA trong phân loại nấm . 14

2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR 15

2.3.1 Khái niệm . 15

2.3.2 Nguyên tắc phản ứng PCR . 15

2.3.3 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng 16

2.3.3.1 Primer và nhiệt độ lai . 16

2.3.3.2 DNA mẫu 16

2.3.3.3 Enzyme DNA polymerase . 16

2.3.3.4 dNTP . 17

2.3.3.5 Mg2+ và nồng độ Mg2+ 17

2.3.4 Những ứng dụng quan trọng của phản ứng PCR . 17

2.4 Nguyên tắc đọc trình tự . 18

2.4.1 Nguyên tắc phương pháp đọc chuỗi mã Sanger . 18

2.4.2 Nguyên tắc giải trình tự gen bằng máy sequencer . 18

2.4.3 Đọc trình tự sản phẩm PCR . 18

2.5 Nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm Beauveria bassiana 19

2.5.1 Nghiên cứu trong nước . 19

2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 20

3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 22

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 22

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 22

3.2 Phân lập và nhân sinh khối các nguồn nấm Beauveria bassiana 23

3.2.1 Hóa chất và dụng cụ 23

3.2.1.1 Hóa chất 23

3.2.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 23

3.2.2 Phương pháp phân lập nấm 23

3.2.3 Phương pháp nhân sinh khối 24

3.3 Khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các nguồn nấm Beauveria

bassiana có tính độc cao . 25

3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm dùng trong phản ứng PCR 25

3.3.1.1 Hóa chất 25

3.3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 25

3.3.2 Chuẩn bị khuôn DNA 26

3.3.3 Thành phần hóa chấ cho một phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt của

của phản ứng PCR 26

3.3.4 Đánh giá kết quả 27

3.3.5 Quy trình khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 dùng 2 primer

ITS4 và ITS5 27

3.3.6 Bố trí thí nghiệm trong phản ứng PCR 28

3.4 Đọc trình tự sản phẩm PCR . 29

3.4.1 Chuẩn bị DNA khuôn 29

3.4.1.1 Tinh sạch sản phẩm PCR 29

3.4.1.2 Định lượng DNA đã được tinh sạch 30

3.4.2 Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator v3.1

Sequencing Kit . 30

3.4.2.1 Thành phần hóa chất . 30

3.4.2.2 Chu kỳ nhiệt của phản ứng đọc trình tự . 31

3.4.3 Tinh sạch sản phẩm khuếch đại . 31

3.4.4 Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer 31

3.4.5 Quy trình tóm tắt các bước đọc trình tự 32

3.4.6 Bố trí thí nghiệm tinh sạch, đọc trình tự và phân tích kết quả 32

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập và nhân sinh khối nấm trong môi trường CZA 34

4.2 Kết quả lio trích DNA tổng số các nguồn nấm Beauveria bassiana 35

4.3 Kết quả khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 . 37

4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 41

4.5 Kết quả đọc trình tự . 42

4.5.1 Kết quả đọc trình tự trên máy sequencer . 42

4.5.1.1 PUL-Q2-4 42

4.5.1.2 RN-LA-10 . 42

4.5.2 Kết quả tìm trình tự đáng tin cậy . 43

4.5.2.1 PUL-Q2-4 43

4.5.2.2 RN-LA-10 . 45

4.5.3 So sánh trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của PUL-Q2-4

và RN-LA-10 . 45

4.5.4 So sánh trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 với các nguồn

nấm Beauveria bassiana từ cơ sở dữ liệu NCBI 46

4.5.5 Biểu đồ phân nhánh . 49

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận . 50

5.2 Đề nghị 50

5.3 Giới hạn đề tài . 51

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 52

PHỤ LỤC . 57

Nấm Beauveria bassiana có hiệu lực cao tiêu diệt nhiều loài côn trùng gây hại, chiếm vị trí quan trọng trong các chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh từ vi nấm. Để nâng cao hiệu quả ứng dụng của nấm này cần đẩy mạnh các nghiên cứu ở mức độ sinh học phân tử nhằm xác định mối quan hệ di truyền của các nguồn nấm Beauveria bassiana thu thập được và mối liên hệ của tính độc với đặc điểm di truyền của nấm. Vùng ITS - rDNA là vùng trình tự tương đối bảo tồn có ý nghĩa lớn trong phân loại, do đó chúng tôi tiến hành khuếch đại và đọc trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các nguồn nấm Beauveria bassiana có tính độc cao nhằm xác định sự biến đổi trong trình tự của vùng này.

Kết quả đạt được:

Phân lập được nguồn nấm Beauveria bassiana SCL - KG.

Thu thập các nguồn nấm Beauveria bassiana có tính độc cao, tiến hành nhân sinh khối, li trích DNA, và khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 bằng 2 primer ITS4 và ITS5 đã khuếch đại được đoạn DNA kích thước khoảng 580 bp của các nguồn nấm SCL-KG-37, RM-TD-11, SCL-LA-5, SX-DL-9, PUL-BC-4, DTB-5, PUL-Q2-4, PUL-BC-6, BH-BD-11, SCL-LA-8, BH-BD-13, RN-LA-10, DTB-9, SCL-LA-6, CC-TD-4, SCL-KG-3, BXD-Q9-8, SN-PT-9, BH-BD-12.

Đọc trình tự sản phẩm PCR của 2 nguồn nấm PUL-Q2-4 RN-LA-10. Trình tự vùng ITS – rDNA của hai nguồn nấm này hoàn toàn giống nhau. Đoạn trình tự đọc được có kích thước 411 bp trong đó gen 5,8 S có kích thước 158 bp, vùng ITS1và ITS2 có kích thước lần lượt là 132 và 121 bp.

So sánh trình tự 2 nguồn nấm PUL-Q2-1 và RN-LA-10 với 6 nguồn nấm ký sinh trên nhiều ký chủ khác nhau từ cơ sở dữ liệu NCBI cho thấy tỷ lệ tương đồng trên toàn vùng là 94,4 %. Tỷ lệ tương đồng của 3 vùng ITS1, 5,8 S, ITS2 lần lượt là 93,5 %, 99,9 % và 90,1 %. Tỷ lệ tương đồng trong vùng 5,8 S cao hơn vùng ITS1 và ITS2 rất nhiều.

Qua kết quả trên cho thấy vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana khá đa dạng rất có ý nghĩa trong xác định quan hệ di truyền giữa các nguồn nấm có tính độc cao và tìm mối liên hệ giữa những biến đổi của vùng này với tính độc.

Đề tài này giúp tạo cơ sở cho nghiên cứu xác định sự biến đổi trình tự ITS - rDNA trên tất cả các nguồn nấm Beauveria bassiana thu thập được trong nước từ đó so sánh chọn lọc nguồn nấm có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại