[FONT="]XÁC ĐỊNH GEN GÂY ĐỘC VÀ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN

[FONT="]CỦA NẤM [FONT="]Metarrhizium anisopliae [FONT="]KÝ SINH

[FONT="]TRÊN CÔN TRÙNG

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu: “Xác định gen gây độc Pr1 và tính đa dạng di truyền đoạn gen Pr1của nấm Metarrhizium anisopliae trên côn trùng gây hại” được thực hiện từ ngày 14 tháng 2 năm 2005 đến ngày 1 tháng 8 năm 2005 tại trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.

Đề tài do Huỳnh Ngọc Phương thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Võ Thị Thu Oanh và TS. Lê Đình Đôn.

Đối tượng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng

gây hại. Nấm này có tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng nhu động ruột, phá vở các hoạt

động bình thường của côn trùng dẫn đến côn trùng bị chết khô. Hiện nay nấm

Metarrhizium anisopliae đã xuất hiện khắp nơi trong nước và đã góp phần không nhỏ

vào việc tạo ra các chế phẩm vi sinh dùng diệt côn trùng gây hại trên cây trồng. Nấm

Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana được xem như những yếu tố

kiểm soát sinh học góp phần tạo nên nền nông nghiệp sạch và bền vững.

Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dòng nấm Metarrhizium anisopliae ở cấp độ phân tử giúp chọn lọc đúng những dòng nấm Metarrhizium anisopliae có tính độc đảm bảo hoạt tính diệt côn trùng lâu dài và hiệu quả. Ngoài ra còn cung cấp những thông tin về tính đa dạng của gen Pr1 nhằm giúp cho việc phát hiện gen Pr1 được dễ dàng hơn.

Các nội dung nghiên cứu bao gồm:

1. Phân lập và tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số sâu hại ngoài đồng ruộng.

2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) liên quan đến tính độc của nấm Metarrhizium anisopliae.

3. Giải trình tự đoạn gen Pr1 và so sánh trình tự này với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank).

Kết quả thu được như sau:

1. Phân lập được 12 nguồn nấm ký sinh trên nhiều côn trùng khác nhau như: bọ

xít đen, bọ dừa, rầy nâu, sâu cuốn lá lúa, rầy bông cúc ở các tỉnh: Tiền Giang, Long

An, Bến Tre, Trà Vinh, Tây Ninh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh, Quận 2 thành phố

Hồ Chí Minh.

2. Sử dụng kỹ thuật PCR đã cho phép phát hiện gen Pr1có kích thước 1.5 kb với cặp mồi METPR1/METPR4. Với 12 dòng nấm phân lập được, tôi đã phát hiện ra 5 dòng (BXĐTG1, BXĐTV7, BXĐLA3, RBCQ915, RBCQ92) là có gen Pr1.

3. Kết quả đọc trình tự cho thấy có một số sai khác giữa các dòng nấm Metarrhizium anisopliae của Việt Nam và thế giới. Tuy nhiên, hai mẫu nấm được giải trình tự là BXĐTG1 và BXĐTV7 không thấy có sự khác biệt.

4. Độ tương đồng của gen Pr1 của hai mẫu BXĐTG1 và BXĐTV7 so với các mẫu trên genbank khá cao (96 - 99.8%).

Những kết quả trong nghiên cứu thể hiện tính hiện đại qua sự kết hợp của công

nghệ gen và công nghệ vi sinh - là hai công nghệ nền của công nghệ sinh học hiện đại.

Kết quả nghiên cứu này sẽ góp phần nhất định trong việc thúc đẩy triển khai nghiên cứu, ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại không những phục vụ trực tiếp cho công tác chọn giống vi sinh, mà còn phục vụ cho công tác bảo vệ thực vật trên thực tế.

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt . iv

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt . ix

Danh sách các bảng . x

Danh sách các hình xi

1. MỞ ĐẦU . 1

1.1. Đặt vấn đề . 1

1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài . 2

1.2.1. Mục đích 2

1.2.2. Mục tiêu . 3

1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu . . 3

1.3. Đối tượng nghiên cứu 3

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4

2.1. Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay 4

2.2. Giới thiệu về nấm ký sinh trên côn trùng . 4

2.2.1. Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae. 5

2.2.2. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm. . . 9

2.3. Sơ lược về phương thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng. 10

2.4. Hoạt tính sinh học . 13

2.5. Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về nấm Metarrhizium anisopliae

và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại. 17

2.5.1. Nghiên cứu trong nước . 17

2.5.2. Nghiên cứu ngoài nước 17

2.6. Vai trò của protease Pr1 . 18

2.7. Phương pháp phát hiện gen Pr1 . 19

2.8. Phản ứng PCR . 20

2.8.1. Giới thiệu chung về PCR 20

2.8.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR . 21

2.8.3. Các ứng dụng của phương pháp PCR . 23

2.8.3.1. Sử dụng phương pháp PCR tổng hợp mẫu dò cho các thử nghiệm

S1 nuclease . 23

2.8.3.2. Sử dụng PCR để sàng lọc 23

2.8.3.3. Sử dụng PCR cho việc thiết kế nhanh các gen tổng hợp 24

2.8.3.4. Sử dụng PCR trong việc kiểm nghiệm . . 24

2.8.3.5. Định lượng bằng phương pháp PCR . 25

2.8.3.6. Một số ứng dụng khác của kỹ thuật PCR . 26

2.8.4. Những hạn chế của phương pháp PCR 26

2.9. Phương pháp xác định trình tự nucleotide . 27

2.9.1. Nguyên tắc hoá học: phương pháp Maxam và Gilbert 28

2.9.2. Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotid

của Sanger. . 28

3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 30

3.1. Thời gian và địa điểm 30

3.1.1. Thời gian 30

3.1.2. Địa điểm . 30

3.2. Vật liệu và hoá chất . 30

3.2.1. Vật liệu . 30

3.2.1.1. Mẫu thí nghiệm 30

3.2.1.2. Các primer dùng trong khuếch đại gen và giải trình tự 31

3.2.2. Hoá chất và môi trường 31

3.2.2.1. Các hóa chất dùng để chiết tách DNA từ khối sợi nấm . 31

3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di 31

3.2.2.3. Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio - Rad cung cấp) . 32

3.2.2.4. Môi trường . . 32

3.2.3. Các thiết bị chính 32

3.3. Nội dung nghiên cứu . 32

3.4. Phương pháp nghiên cứu . . 33

3.4.1. Phân lập và tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số sâu

hại cây trồng . 33

3.4.1.1. Chuẩn bị môi trường PGA . . 33

3.4.1.2. Phương pháp tách bào tử . . 33

3.4.2. Xác định qui trình PCR phát hiện gen Pr1 liên quan tới tính độc

của nấm Metarrhizium anisopliae . 33

3.4.2.1. Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm . 33

3.4.2.2. Phương pháp ly trích DNA . 34

3.4.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA 34

3.4.2.4. Khuếch đại gen Pr1-PCR . 35

3.4.2.5. Điện di trên gel agarose 36

3.4.2.6. Đọc kết quả điện di . . 37

3.4.3. Sử dụng phương pháp giải trình tự để xác định và phát hiện sự sai khác

cụ thể trong đa dạng di truyền nấm Metarrhizium anisopliae 37

3.4.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR 37

3.4.3.2. Lượng DNA thích hợp cho đọc trình tự 38

3.4.3.3. Thành phần của phản ứng đọc trình tự . . 39

3.4.3.4. Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự . 39

3.4.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR 39

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

4.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số

sâu hại cây trồng . . 41

4.2. Sử dụng phương pháp PCR phát hiện gen liên quan đến tính độc của

nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1). . . 43

4.2.1. Quy trình ly trích DNA của các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae. . 43

4.2.2. Tiến hành phản ứng PCR . 45

4.2.3. Xác định trình tự nucleotide trong đoạn gen gây độc Pr1 của nấm

Metarrhizium anisopliae. . . 47

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . . 53

5.1. Kết luận . 53

5.1.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae . 53

5.1.2. Phương pháp ly trích DNA và kỹ thuật PCR . 53

5.1.3. Phương pháp đọc trình tự gen Pr1 53

5.2. Đề nghị . . 53

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 56

7. PHỤ LỤC . . 5