Mục lục

Mở đầu

Phần 1 Tổng quan tài liệu

1.1. Đặc điểm của cây đu đủ

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại

1.1.2. Giá trị kinh tế

1.1.3. Phân bố

1.1.4. Các bệnh về cây đu đủ

1.2. Đặc điểm virus gây bệnh đốm vòng ở đu đủ (PRSV)

1.2.1. Cấu trúc

1.2.2. Cơ chế lan truyền

1.2.3. Các biện pháp phòng trừ

1.2.4. Gen kháng virus

1.2.5. Những thành tựu trong việc chống lại PRSV ở cây đu đủ

1.2.5.1. Trường đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ

1.2.5.2. Trường đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia

1.2.5.3. Trung tâm Công nghệ sinh học, MARDI, Malaysia

1.3. Công nghệ sinh học phân tử và ứng dụng để tạo cây chuyển gen

1.3.1. Một số vector sử dụng trong sinh học phân tử

1.3.1.1 Vector nhân dòng TA-cloning

1.3.1.2 Vector biểu hiện protein pRSET

1.3.1.3 Vector chuyển gen

1.3.2. Một số loại enzim sử dụng trong sinh học phân tử

1.3.2.1 Enzim sao mã ngược (reverse transcriptase)

1.3.2.2 Enzim ligase

1.3.2.3 Enzim DNA polymerase

1.3.2.4 Enzim cắt giới hạn (restriction enzim)

1.3.2.5 Enzim Mung-bean nuclease

1.3.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử

1.3.3.1 Kỹ thuật RT-PCR

1.3.3.2 Kỹ thuật Western blotting

1.4. Công nghệ thông tin và ứng dụng trong sinh học phân tử

1.4.1. Phần mềm tin học DNAstar sử dụng trong SHPT

1.4.2. Internet và SHPT.

Phần 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Nguyên liệu

2.2. Phương pháp

2.2.1. Tách RNA tổng số chứa mRNA mã hoá protein vỏ của virus PRSV

2.2.2. Phương pháp điện di

2.2.3. Thiết kế Primer

2.2.4. Phương pháp RT-PCR

2.2.5. Phương pháp tách và tinh sạch DNA từ gel Agarose bằng ly tâm

2.2.6. Phản ứng ghép nối đoạn gen với vector

2.2.7. Phương pháp xử lý với enzim giới hạn và Mung-bean nuclease

2.2.8. Phương pháp biến nạp

2.2.9. Kiểm tra khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp bằng PCR

2.2.10. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli

2.2.11. Phân tích trình tự nucleotide

2.2.12. Thiết kế vector chuyển gen mang gen PRSVN

2.2.13. Biểu hiện gen CP trong E.coli

2.2.14. Western blotting

Phần 3 Kết quả và thảo luận

Phần 4 Kết luận và đề nghị

Phần 5 Tài liệu tham khảo

Mở đầu

Đu đủ là cây ăn quả được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Quả chín để ăn tráng miệng và quả xanh được dùng làm salad. Ngoài ra nhựa đu đủ còn là nguyên liệu tách chế phẩm enzim papain có giá trị thương mại sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và thuộc da. ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ vào khoảng 2500 ha với sản lượng khoảng 100.000 tấn ước tính đạt 200 - 300 tỉ đồng .

Nhưng hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự hoành hành của bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra. Virus này thuộc nhóm Potyirus có vật liệu di truyền là sợi ARN đơn. Khi virus này nhiễm vào cây đu đủ thì làm cho lá cây có những vòng đốm và mất khả năng quang hợp dẫn đến giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng quả. Bệnh được truyền do các loại rệp cây nên lan rộng rất nhanh. Đến nay toàn bộ các vùng trồng đu đủ ở nước ta cũng như Austrailia , Thái Lan , Đài Loan , Malaysia . và đặc biệt là Hawaii đều đã bị nhiễm bệnh.

Những phương pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan rộng của PRSV như chặt bỏ cây bị bệnh, cách ly vùng bị bệnh , sử dụng thuốc trừ sâu để diệt rệp truyền bệnh hay sử dụng chủng PRSV yếu cho nhiễm vào cây chưa bị bệnh để ngăn sự nhiễm các chủng mạnh hơn theo cơ chế bảo vệ chéo [19,20]. Nhưng những phương pháp này chỉ làm giảm sự lan truyền mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này.

Hiện nay nhờ ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, người ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đưa gen mã hoá protien vỏ (coat proetin gene) của virus vào genom của thực vật. Thành công đầu tiên là ở thuốc lá và cà chua kháng lại virus khảm thuốc lá . Sau đó là sự kháng lại nhiều loại virus khác như cucumber mosaic virus , alfalfa mosaic virus và potato leaf roll virus . Gần đây ở Hawaii đã tạo được dòng đu đủ 55-1 kháng lại PRSV [2,3]. Dòng đu đủ được chuyển gen này đã trở thành giống thương mại sau khi lai với giống Kapoho . Nhưng tính kháng của cây đu đủ chuyển gen này chỉ có hiệu quả đối với các chủng virus của Hawai mà không kháng với các chủng virus từ các vùng khác . Chính vì vậy mà cần phải tách dòng gen mã hoá protien vỏ (coat protein gene) từ chính các virus gây bệnh của vùng đó thì mới có khả năng tạo ra cây kháng bệnh.

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã xây dựng đề tài: " Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở việt nam". Với mục đích là tạo được một vector chuyển gen mang gen mã hoá cho protein vỏ của PRSV của Việt Nam phục vụ cho việc chuyển gen này vào cây đu đủ tạo ra giống đu đủ mới có khả năng kháng lại PRSV ở Việt Nam