MỞ ĐẦU

Bệnh truyền nhiễm là căn bệnh nguy hiểm cướp đi sinh mạng của rất nhiều người trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển. Cho đến nay bệnh truyền nhiễm vẫn chưa có thuốc điều trị hoặc nếu có thì giá thành vẫn còn cao so với mức thu nhập của người dân ở các nước này. Vì vậy vaccine đã trở thành phương tiện quan trọng và hiệu quả trong việc phòng và chống lại các căn bệnh truyền nhiễm .

Nằm trong số những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, bệnh dại vẫn còn là vấn đề nghiêm trọng với các nước đang phát triển, gây ra tỷ lệ tử vong cao cho người và gia súc. Hàng năm, có khoảng 50.000 người chết vì những căn bệnh này và có tới 10 triệu liều vaccine được dùng. Hơn 99% người chết do bệnh dại là ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ trong đó chỉ tính riêng Ấn Độ mỗi năm có tới 30.000 người chết (Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới). Hiện nay, có hơn 2,5 tỷ người đang sống trong vùng có tiềm ẩn bệnh dại, trong đó trẻ em ở vào độ tuổi từ 5 - 15 có nguy cơ mắc bệnh cao nhất .

Ở Việt Nam, bệnh dại vẫn đang là vấn đề nan giải. Theo số lượng thống kê của Viện Paster chỉ tính riêng thành phố Hồ Chí Minh, năm 2001, trên địa bàn Thành phố có 82.000 người bị súc vật cắn phải đi tiêm phòng tại các cơ quan y tế. Nhưng hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị căn bệnh này, vì vậy việc phòng chống bệnh bằng vaccine là phương pháp tối ưu nhất. Tuy nhiên, những loại vaccine trên thị trường hiện nay phổ biến là loại vaccine bất hoạt. Vaccine này có nhiều hạn chế như phản ứng phụ cao, không an toàn tuyệt đối, virus có thể phục hồi lại khả năng gây bệnh.

Sự phát triển của công nghệ sinh học đã cho phép tạo ra những loại vaccine hoàn toàn mới. Những loại vaccine này có thể từ trước tới nay chưa hề có, hoặc đơn giản có thể chỉ là những vaccine có hiệu lực cao hơn và phản ứng phụ ít hơn so với vaccine cổ điển. Hiện nay, sử dụng phương pháp ADN tái tổ hợp trên các đối tượng khác nhau như E. coli, nấm men người ta đã tạo thành công một số loại vaccine thế hệ mới. Nhưng đối với vaccine dại và một số loại vaccine khác việc biểu hiện trong các tế bào vi sinh vật lại gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất vaccine trên các đối tượng cây trồng (khoai lang, đu đủ, lạc, cà chua, thuốc lá ) đang được nhiều nhà khoa học quan tâm vì tính hiệu quả của nó. Sản xuất vaccine tái tổ hợp trên các đối tượng cây trồng sẽ giảm giá thành xuống rất nhiều so với vaccine đang được sản xuất trên tế bào động vật. Vì vaccine thực vật có thể sản xuất được một lượng lớn, kỹ thuật đơn giản phù hợp với trình độ các nước nghèo và đang phát triển. Hơn thế nữa, vì là vaccine ăn hoặc uống được, nên vaccine thực vật đơn giản hoá các bước khi sử dụng và bảo quản [1, 13].

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen” với mục đích tạo ra vectơ tái tổ hợp mang gen mã hoá kháng nguyên vỏ của virus dại có khả năng gây đáp ứng miễn dịch để chuyển vào thực vật, nhằm tạo ra cây trồng chuyển gen có khả năng sản xuất vaccine tái tổ hợp ăn, uống được.

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU .1

[URL="/#_Toc105348726"]Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

[URL="/#_Toc105348727"]1.1. Giới thiệu chung về vaccine. 3

[URL="/#_Toc105348728"]1.1.1. Vaccine và hiệu quả phòng chống bệnh truyền nhiễm 3

[URL="/#_Toc105348729"]1.1.2. Vaccine tái tổ hợp. 4

[URL="/#_Toc105348730"]1.2. Bệnh dại ( Rabies disease). 5

[URL="/#_Toc105348731"]1.2.1. Gen mã hoá cho kháng nguyên glycoprotein của virus dại 7

[URL="/#_Toc105348732"]1.2.2. Phân tử glycoprotein của virus dại và cơ chế gây miễn dịch . 9

[URL="/#_Toc105348733"]1.3. Vi khuẩn Agrobacterium timefaciens và hiện tượng biến nạp gen vào thực vật. 10

[URL="/#_Toc105348734"]1.4. Giới thiệu chung về vectơ sử dụng trong chuyển gen. 11

[URL="/#_Toc105348735"]1.4.1. Vectơ nhị thể (binary vector). 11

[URL="/#_Toc105348736"]1.4.2. Vectơ pBI121. 12

[URL="/#_Toc105348737"]1.4.3. Tình hình nghiên cứu vaccine thực vật trên thế giới 155

[URL="/#_Toc105348738"]Chương 2. VẬT LIỆU V À PHƯƠNG PHÁP. 177

[URL="/#_Toc105348739"]2.1.Vật liệu nghiên cứu. 177

[URL="/#_Toc105348740"]2.1.1. Các chủng vi sinh vật và cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu. 177

[URL="/#_Toc105348741"]2.1.2. Hoá chất, thiết bị 177

[URL="/#_Toc105348742"]2.2. Phương pháp nghiên cứu. 18

[URL="/#_Toc105348743"]2.2.1. PCR nhân gen đặc hiệu. 19

[URL="/#_Toc105348744"]2.2.2. Phương pháp điện di 20

[URL="/#_Toc105348745"]2.2.3. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR 20

[URL="/#_Toc105348746"]2.2.4. Cắt bằng enzym giới hạn. 22

[URL="/#_Toc105348747"]2.2.5. Phản ứng ghép nối 22

[URL="/#_Toc105348748"]2.2.6. Phương pháp tạo tế bào E. coli khả biến. 23

[URL="/#_Toc105348749"]2.2.7. Biến nạp vectơ pBI121 đã gắn gen GlyP vào tế bào khả biến E. coli DH5a theo phương pháp sốc nhiệt 23

[URL="/#_Toc105348750"]2.2.8. Tách plasmid bằng phương pháp Sambrook. 24

[URL="/#_Toc105348751"]2.2.9. Phương pháp tạo tế bào khả biến A. tumefaciens. 25

[URL="/#_Toc105348752"]2.2.10. Biến nạp Ti-plasmid vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện (Electroporation method). 26

[URL="/#_Toc105348753"]Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

[URL="/#_Toc105348754"]3.1. Chuẩn bị vectơ pBI121 và gen glyP 28

[URL="/#_Toc105348755"]3.1.1. Tách vectơ pBI121 từ chủng E. Coli Top 10. 28

[URL="/#_Toc105348756"]3.1.2. Khuyếch đại gen GlyP bằng kỹ thuật PCR 28

[URL="/#_Toc105348757"]3.2. Thiết kế ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 Mang gen GlyP dưới sự điều khiển của đoạn khởi động 35S và đoạn kết thúc NOS. 30

[URL="/#_Toc105348758"]3.2.1. Cắt enzym hạn chế tạo đầu dính và ghép nối tạo vectơ tái tổ hợp. 30

[URL="/#_Toc105348759"]3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α. 32

[URL="/#_Toc105348760"]3.2.3. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen GlyP trong các dòng khuẩn lạc bằng kỹ thuật colony-PCR 33

[URL="/#_Toc105348762"]3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen GlyP trong Ti-plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế 36

[URL="/#_Toc105348763"]3.4. Kết quả biến nạp Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen glyP vào tế bào A. tumefaciens. 36

[URL="/#_Toc105348764"]3.3.1. Biến nạp Ti-plasmid tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens. 36

[URL="/#_Toc105348765"]3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của vectơ Ti-plasmid tái tổ hợp trong các dòng khuẩn lạc bằng colony-PCR và cắt enzym hạn chế. 38

[URL="/#_Toc105348766"]KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 41

[URL="/#_Toc105348767"]TÀI LIỆU THAM KHẢO 4