MỤC LỤC

PHẦN TRANG

Trang tựa

Lời cảm tạ i

Tóm tắt . .ii

Mục lục iii

Danh sách các chữ viết tắt . . vi

Danh sách các hình .v ii

Danh sách các bảng .v ii

1. MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề . 1

1.2. Mục đích - Yêu cầu . 2

1.2.1. Mục đích 2

1.2.2. Yêu cầu 2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg.

2.2. Sơ lược về nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei . . 4

2.2.1. Lịch sử phát hiện 4

2.2.2. Phạm vi phân bố 4

2.2.3. Phạm vi ký chủ và khả năng gây bệnh 5

2.2.4. Đặc tính sinh học của C. cassiicola 5

2.3. Nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su Hevea brasiliensis

Muell. Arg 6

2.3.1. Sự xuất hiện của nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su

Hevea brasiliensis . . 6

2.3.2. Tình hình bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su tại một số nước

trồng cao su 6

2.3.3. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su . 9

2.4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh do C. cassiicola . . 9

2.5. Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) 10

2.5.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR 10

2.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 12

2.6. Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease - RE) . 14

2.6.1. Giới thiệu 16

2.6.2. Định danh các enzyme 15

2.6.3. Trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn . 16

2.6.4. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA 16

2.6.5. Phân tích kết quả của các phản ứng cắt bằng RE . 18

2.6.6. Bản đồ giới hạn 19

2.7. Vùng ITS và vai trò của nó trong phân tích đa dạng di truyền 19

2.8. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong và ngoài nước . 21

2.8.1. Những nghiên cứu về C. cassiicola ngoài nước 21

2.8.2. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong nước 23

3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH . 24

3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành . 24

3.1.1. Thời gian . 24

3.1.2. Địa điểm . 24

3.1.3. Đối tượng nghiên cứu . 24

3.2. Nội dung nghiên cứu 24

3.2.1. Phân lập nấm nguồn nấm C. cassiicola 24

3.2.1.1. Hóa chất và dụng cụ 24

3.2.1.2. Phương pháp lấy mẫu 25

3.2.1.3. Phương pháp phân lập . 25

3.2.2. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR 26

3.2.2.1. Chuẩn bị DNA khuôn mẫu cho phản ứng PCR . 26

3.2.2.2. Thực hiện phản ứng PCR 28

3.2.2.3. Đọc kết quả của phản ứng PCR 30

3.2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng các enzyme cắt giới hạn (RE) 30

3.2.3.1. Hóa chất và dụng cụ . 31

3.2.3.2. Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP . 31

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 32

4.1. Về tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora . 32

4.2. Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola . 37

4.3. Kết quả PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola . 37

4.4. Kết quả phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS 40

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . . 46

5.1. Kết luận . 46

5.2. Đề nghị . . 46

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 48

7. PHỤ LỤC . 52

PHẦN I

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Nấm bệnh trên cây trồng, đặc biệt là nấm ký sinh là dịch hại nguy hiểm đối với nền

nông nghiệp của nhiều quốc gia trên thế giới. Trong đó, nấm Corynespora cassiicola

(Berk. and Curt.) Wei có khả năng phân bố và phổ ký chủ rộng đã gây thiệt hại đáng

kể cho nền kinh tế của nhiều nước. Trong phổ ký chủ, Corynespora cassiicola gây hại

đặc biệt nghiêm trọng cho cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.), đây là loại cây

công nghiệp có giá trị kinh tế cao được trồng nhiều ở các nước Đông Nam Á, châu Phi

và Nam Mỹ.

Trên cây cao su, C. cassiicola gây ra bệnh rụng lá - còn được gọi là bệnh rụng lá

Corynespora, bệnh này có thể xảy ra trên cây cao su thuộc mọi lứa tuổi và xảy ra

quanh năm, gây thiệt hại rất lớn về năng suất mủ cao su. Bệnh này đã bùng phát thành

những đợt dịch bệnh và được ghi nhận lần đầu tiên vào những năm 1980 ở Sri Lanka,

Indonesia, Malaysia và Thái Lan trên các dvt mẫn cảm như RRIC 103, RRIM 725,

KRS 21, PPN 2447. Trong khoảng thời gian từ 1980 - 1988, ở Indonesia, khoảng 1200

ha cao su đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng, thiệt hại khoảng 400 ha, ước tính giá trị thiệt

hại lên đến 50 triệu USD (theo CFC/INRO Project Proposal, 1999). Trong những năm

gần đây, khả năng gây hại của nấm C. cassiicola ngày càng lớn và ngày càng có nhiều

dvt cao su bị nhiễm bệnh. Biện pháp phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora bằng hóa

chất khá tốn kém và được nhận định là không kinh tế bằng cách thay thế các dvt mẫn

cảm bằng các dvt có tính kháng (Chee, 1988). Dịch bệnh do nấm C. cassiicola gây ra

thường làm kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản và thời gian phục hồi của những dvt bị

nhiễm bệnh. Trước tình hình đó, người trồng cao su thường được khuyến cáo trồng các

dvt có tính kháng bệnh. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của các dòng C. cassiicola là rất

khác nhau tùy thuộc vào dvt cao su khác nhau và các điều kiện môi trường như nhiệt

độ, độ ẩm, lượng mưa, độ cao và độ màu mỡ của đất. Các nghiên cứu trên thế giới cho

thấy nấm C. cassiicola trên cây cao su có sự phân hóa về di truyền (CFC/INRO Project

Proposal, 1999; Safia và Noor Hisham, 2003). Do vậy, việc xác định sự đa dạng sinh

học, đặc biệt là đa dạng ở mức độ phân tử của C. cassiicola là việc rất cần thiết. Đây

chính là tiền đề cho việc xác định các marker phân tử có liên quan đến tính độc của C.

cassiicola và phục vụ cho việc nghiên cứu tính kháng trên các dvt cao su.

Ở Việt Nam, bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su đã được ghi nhận vào tháng

09/1999, gây hại nặng cho các dvt RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Hiện nay, số

lượng dvt cao su bị nhiễm bệnh đã tăng lên nhiều, bệnh đã xuất hiện tại một số công ty

cao su ở miền Đông Nam Bộ (Phan Thành Dũng, 2004) và một số tỉnh phía Bắc như

Hà Tây và Nghệ An (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật, 2000). Những nghiên cứu về bệnh

này ở Việt Nam hiện chưa nhiều và mới chỉ dừng lại ở phân tích, đánh giá tình hình

bệnh cũng như tính kháng của một số dvt cao su đối với nấm C. cassiicola. Việc ứng

dụng các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh và nghiên cứu về nấm C.

cassiicola chưa nhiều trong khi bệnh rụng lá Corynespora ngày càng lan rộng, triệu chứng bệnh ngày càng biến thiên, càng ngày càng có nhiều dvt cao su bị nhiễm bệnh, đã trở thành mối lo ngại của nhiều nước trồng cao su.

Xuất phát từ các vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích đa dạng di

truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên

cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phương pháp RFLP - PCR”.

1.2.Mục đích yêu cầu

1.2.1.Mục đích

Thu thập và phân lập nấm C. cassiicola trên lá cao su bị bệnh có biểu hiện các triệu chứng đặc trưng, không đặc trưng trên các dvt cao su khác nhau, tại một số địa điểm khác nhau.

Xác định sự khác biệt di truyền giữa các mẫu nấm C. cassiicola phân lập từ các dvt cao su khác nhau bằng phương pháp RFLP - PCR (Restriction Fragments Length Polymorphism - Polymerase Chain Reaction).

1.2.2. Yêu cầu

Nhận dạng được các triệu chứng biểu hiện của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su.

Nắm vững kỹ thuật nuôi cấy và phân lập nấm C. cassiicola.

Nắm vững kỹ thuật PCR và sử dụng các enzyme cắt giới hạn