Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 2

Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 3

2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3

2.1.2. Định nghĩa về enzyme 4

2.1.3. Cấu tạo phân tử 4

2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại 6

2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 6

2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM 8

2.2.1. Giới thiệu về tôm 8

2.2.2. Khái quát protease 10

2.2.2.1. Định nghĩa protease 10

2.2.2.2. Protease của tôm 11

2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nƣớc và ngoài nƣớc 12

a). Nghiên cứu trong nƣớc 12

b). Nghiên cứu ngoài nƣớc 13

2.2.3. Ứng dụng của protease 14

2.3. PHƢƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU 15

2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme. 15

2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme 16

2.3.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel 18

2.3.3.1. Bản chất của phƣơng pháp 18

2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel 20

a). Chọn lựa gel 20

b). Chuẩn bị gel và bảo quản 20

2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu 20

a). Dựng cột lọc gel 20

b). Chuẩn bị mẫu 21

2.3.3.4. Một số ứng dụng của phƣơng pháp lọc gel 21

2.3.3.5. Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel 22

a). Ƣu điểm 22

b). Nhƣợc điểm 22

2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE 22

2.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME 24

2.5.1. Phương pháp Biuret 24

2.5.2. Phương pháp Lowry 25

2.5.3. Phương pháp Bradford 25

2.5.4. Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) 26

2.5.5. Phương pháp đo phổ 26

Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 27

3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 27

3.2.1. Vật liệu 27

3.2.2. Hóa chất 28

3.2.3. Thiết bị 28

3.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG 29

3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú 29

3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease 29

3.4.3. Bố trí thí nghiệm30

3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp 31

3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC 32

3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT 33

a). Nhiệt độ 33

b). pH 33

c). Nồng độ muối ăn 34

3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel35

3.4.5. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 35

3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu35

Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME 36

4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau 36

4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác

nhau 38

4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác nhau 39

4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác nhau 41

4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp 42

4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC 44

4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau 44

4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau46

4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối bão hòa khác nhau 47

4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân 49

4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CPT 51

4.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 51

4.3.2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 52

4.3.3. Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội

tạng tôm sú 53

4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL 55

4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE 59

Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

5.1. KẾT LUẬN 64

5.2. ĐỀ NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 1

Phụ lục chƣơng 3 69

1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 1

2. Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano 3

3. Phương pháp sắc ký lọc gel 7

4. Điện di SDS-PAGE 9

a). Chuẩn bị hộp điện di 9

b). Chuẩn bị mẫu protein 10

c). Đƣa mẫu vào các giếng 10

Phụ lục chƣơng 4 80