1. MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục đích yêu cầu 2

1.2.1. Mục đích 2

1.2.2. Yêu cầu 2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Giới thiệu khái quát về tôm sú (Penaeus monodon) 3

2.1.1. Phân loại 3

2.1.2.Vùng phân bố 3

2.1.3. Chu kỳ sống 4

2.2. Tình hình dịch bệnh WSSV trên thế giới và Việt Nam 5

2.2.1. Trên thế giới 5

2.2.2. Ở Việt Nam 5

2.3. Bệnh đốm trắng trên tôm 7

2.3.1. Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) 7

2.3.1.1. Định danh và phân loại 7

2.3.1.2. Đặc điểm hình thái 8

2.3.1.3. Đặc tính sinh học 8

2.3.2. Vật chủ mang mầm bệnh WSSV 9

2.3.3. Các con đường lây truyền WSSV 9

2.3.4. Cơ chế xâm nhập 10

2.3.5. Triệu chứng của bệnh 10

2.3.6. Phương pháp chẩn đoán 11

2.4. Phương pháp PCR và các cải tiến 12

2.4.1. Phương pháp PCR 12

2.4.1.1. Nguyên tắc 12

2.4.1.2. Các thành phần của phản ứng PCR 13

2.4.1.3. Các bước phản ứng 13

2.4.1.4. Ứng dụng 14

2.4.1.5. Ưu và nhược điểm 14

2.4.2. Kỹ thuật Nested PCR 15

2.4.2.1. Nguyên tắc 15

2.4.2.2. Ưu và nhược điểm 16

2.4.3. Kỹ thuật Real - time PCR 16

2.4.3.1. Lịch sử phát triển 16

2.4.3.2. Khái niệm 17

2.4.3.3. Nguyên tắc 17

2.4.3.4. Hệ thống Real - time PCR 17

2.4.3.5. Phương pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR 18

2.4.3.6. Nguyên lý định lượng của kỹ thuật Real - time PCR 22

2.4.3.7. Ưu và nhược điểm 23

2.4.3.8. Ứng dụng 23

3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

3.1.1. Thời gian thực hiện 25

3.1.2. Địa điểm thu mẫu 25

3.1.3. Địa điểm phân tích mẫu 25

3.2. Nội dung nghiên cứu 25

3.3. Nguyên vật liệu 25

3.3.1. Mẫu xét nghiệm 25

3.3.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất 26

3.3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ 26

3.3.2.2. Hoá chất 27

3.4. Phương pháp nghiên cứu 28

3.4.1. Thu mẫu và bảo quản mẫu 28

3.4.2. Ly trích mẫu 28

3.4.2.1. Pha dung dịch tách chiết 28

3.4.2.2. Tiến hành ly trích 29

3.4.3. Tiến hành thực hiện Real - time PCR 30

3.4.3.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Real - time PCR 30

3.4.3.2. Thiết lập chương trình thực hiện Real - time PCR trên phần mềm máy iCycler iQ 30

3.4.3.3. Chạy Real - time PCR 31

3.4.3.4. Phân tích kết quả trên màn hình máy vi tính 31

3.4.4. Thực hiện Non Stop Nested PCR 33

3.4.4.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Non Stop Nested PCR 33

3.4.4.2. Thiết lập chương trình thực hiện Non Stop Nested PCR trên phần mềm của máy iCycler 33

3.4.4.3. Chạy Non Stop Nested PCR 33

3.4.4.4. Điện di và phân tích kết quả 34

3.4.5. Cách đọc kết quả 36

3.4.5.1. Real - time PCR 36

3.4.5.2. Non Stop Nested PCR 39

3.5. Bố trí thí nghiệm 40

3.5.1. Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix 40

3.5.2. Thí nghiệm 2: sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính với WSSV 41

3.5.3. Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time PCR 42

3.5.4. Thí nghiệm 4: khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real - time PCR

và Non Stop Nested PCR 43

3.5.5. Thí nghiệm 5: ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế 43

3.5.6. Thí nghiệm 6: theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã được thu mẫu kiểm tra 44

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1. Kết quả thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix 45

4.2. Kết quả sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện virus

gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính với WSSV 46

4.3. Kết quả khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time PCR 53

4.4. Kết quả khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR 57

4.5. Kết quả ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế 60

4.6. Kết quả theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã được thu mẫu kiểm tra 67

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70

5.1. Kết luận 70

5.2. Đề nghị 70

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

7. PHỤ LỤC 75

Phụ lục A TRỌNG LƯỢNG MẪU LY TRÍCH 75

Phụ lục B HÌNH ẢNH VÀ SỐ LIỆU THÔ KẾT QUẢ CHẠY REAL – TIME PCR VÀ NON STOP NESTED PCR 76

Phụ lục C CÁC THUẬT TỪ THƯỜNG DÙNG TRONG REAL – TIME PCR 88

Phụ lục D CÁC BƯỚC VẬN HÀNH MÁY iCycler iQ 9