MỤC LỤC

CHưƠNG TRANG

Trang tựa

Lời cảm ơn---------------------------------------------------------------------------------- iii

Tóm tắt -------------------------------------------------------------------------------------- iv

Summary------------------------------------------------------------------------------------- v

Mục lục-------------------------------------------------------------------------------------- vi

Danh sách các chữ viết tắt ---------------------------------------------------------------- ix

Danh sách các hình ------------------------------------------------------------------------- x

Danh sách các bảng------------------------------------------------------------------------ xi

1. MỞ ĐẦU --------------------------------------------------------------------------------- 1

1.1. Đặt vấn đề ---------------------------------------------------------------------------- 1

1.2. Mục đích------------------------------------------------------------------------------ 2

1.3. Yêu cầu ------------------------------------------------------------------------------- 2

1.4. Giới hạn đề tài ----------------------------------------------------------------------- 2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU------------------------------------------------------------- 3

2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ---------------- 3

2.1.1. Chức năng khu dự trữ sinh quyển------------------------------------------- 3

2.1.2. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ -------------------------- 4

2.1.3. Cấu trúc Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ --------------- 8

2.2. Cây Cóc trắng----------------------------------------------------------------------- 10

2.2.1 Phân loại----------------------------------------------------------------------- 10

2.2.2 Đặc điểm hình thái cây Cóc trắng------------------------------------------ 11

2.3. Các phương pháp dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền------------ 12

2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA ở thực vật --------------------------------- 12

2.3.2. Định lượng và xác định độ tinh sạch của DNA -------------------------- 13

2.3.2.1. Phương pháp đo quang phổ ---------------------------------------------- 13

2.3.2.2. Phương pháp điện di ------------------------------------------------------ 14

2.3.3. PCR ---------------------------------------------------------------------------- 15

2.3.4. Các marker phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền --------------- 19

2.3.4.1. Microsatellite/ SSR ------------------------------------------------------- 19

2.3.4.2. AFLP ------------------------------------------------------------------------21

2.3.4.3. RAPD -----------------------------------------------------------------------25

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện--------------------------------------------------28

3.1.1. Thời gian thực hiện ----------------------------------------------------------28

3.1.2. Địa điểm thực hiện -----------------------------------------------------------28

3.2. Vật liệu thí nghiệm-----------------------------------------------------------------28

3.2.1. Mẫu lá Cóc trắng -------------------------------------------------------------28

3.2.2. Hóa chất thí nghiệm ---------------------------------------------------------29

3.2.2.1. Hóa chất ly trích DNA----------------------------------------------------29

3.2.2.2. Hóa chất kiểm tra định lượng DNA ------------------------------------31

3.2.2.3. Hóa chất thực hiện phản ứng RAPD------------------------------------31

3.2.2.4. Hóa chất dùng trong điện di và đọc kết quả ---------------------------32

3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm ----------------------------------------------------32

3.3. Phương pháp nghiên cứu ----------------------------------------------------------32

3.3.1. Phương pháp ly trích DNA -------------------------------------------------32

3.3.1.1. Quy trình 1 -----------------------------------------------------------------32

3.3.1.2. Quy trình 2 -----------------------------------------------------------------33

3.3.1.3. Quy trình 3 -----------------------------------------------------------------34

3.3.2. Kiểm tra kết quả ly trích DNA ---------------------------------------------35

3.3.2.1. Kiểm tra định lượng DNA bằng quang phổ kế------------------------35

3.3.2.2. Kiểm tra định tính DNA bằng điện di trên gel ------------------------35

3.3.3. Phản ứng RAPD --------------------------------------------------------------36

3.3.3.1. Primer -----------------------------------------------------------------------36

3.3.3.2. Bố trí thí nghiệm ----------------------------------------------------------36

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN-------------------------------------------------------41

4.1. Kết quả thu thập mẫu lá Cóc trắng tại Khu dự trữ sinh quyển

rừng ngập mặn Cần Giờ ------------------------------------------------------------------41

4.2. Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA -------------------------42

4.2.1. Bảo quản mẫu-----------------------------------------------------------------42

4.2.2. Hoàn thiện quy trình ly trích------------------------------------------------43

4.3. Thực hiện phản ứng RAPD-----------------------------------------------------50

4.3.1. Thí nghiệm 1------------------------------------------------------------------50

4.3.2. Thí nghiệm 2------------------------------------------------------------------51

4.3.3. Thí nghiệm 3------------------------------------------------------------------54

4.3.4. Thí nghiệm 4------------------------------------------------------------------55

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ----------------------------------------------------------59

5.1. Kết luận------------------------------------------------------------------------------59

5.2. Đề nghị ------------------------------------------------------------------------------60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ----------------------------------------------------------------61

PHỤ LỤC-----------------------------------------------------------------------------------63

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1. Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ------------------ 5

Hình 2.2 Cây Cóc trắng ------------------------------------------------------------------ 10

Hình 2.3 Lá Cóc trắng -------------------------------------------------------------------- 11

Hình 2.4. Hoa Cóc trắng ----------------------------------------------------------------- 12

Hình 2.5. Trái Cóc trắng ----------------------------------------------------------------- 12

Hình 2.6. Các bước cơ bản của phản ứng PCR --------------------------------------- 17

Hình 2.7. Cơ chế cắt của hai enzyme---------------------------------------------------22

Hình 2.8. Cơ chế gắn của 2 adapter MseI và EcoRI----------------------------------22

Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc --------------------------------------------23

Hình 4.1. Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ -----------------------------------------41

Hình 4.2. Mẫu lá Cóc trắng sau 30 ngày bảo quản -----------------------------------42

Hình 4.3. Quy trình 3 (quy trình ly trích nghiền trong N2 lỏng) --------------------45

Hình 4.4. Gel điện di kết quả ly trích DNA theo quy trình 2 và 3------------------46

Hình 4.5. Lá Cóc trắng bị đốm nâu và sâu ăn -----------------------------------------47

Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA từ mẫu lá tươi ban đầu

theo quy trình 2 và mẫu lá bảo quản sau 30 ngày theo quy trình 3 -----------------48

Hình 4.7. Hình điện di sản phẩm PCR ở thí nghiệm 1 -------------------------------50

Hình 4.8. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer 1 -------------------------------52

Hình 4.9. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer 2 và 9 -------------------------52

Hình 4.10. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 --------------------53

Hình 4.11. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer RAH8, OPA5, OPA10 ----53

Hình 4.12. Hình điện di sản phẩm RAPD của thí nghiệm 3-------------------------54

Hình 4.13. Hình điện di sản phẩm RAPD của thí nghiệm 4-------------------------55

Hình 4.14. Cây phân loại một số cây Cóc trắng tại Khu dự trữ sinh quyển

rừng ngập mặn Cần Giờ ------------------------------------------------------------------57

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 2.1. Nồng độ gel và kích thước đoạn cần phân tách --------------------------- 15

Bảng 3.1. Thành phần hóa chất phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 ---------------37

Bảng 3.2. Chu trình nhiệt 1 cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1----------------37

Bảng 3.3. Chu trình nhiệt 2 cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1----------------37

Bảng 3.4. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 ---------38

Bảng 3.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 ------------------38

Bảng 3.6. Thành phần hóa chất trong thí nghiệm 3-----------------------------------39

Bảng 3.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 ------------------4