MỤC LỤC

CHưƠNG .TRANG

Trang tựa i

Lời cảm tạ .iii

Tóm tắt .iv

Summary v

Mục lục .vi

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình .x

Danh sách các chữ viết tắt xi

CHưƠNG 1. MỞ ĐẦU .1

1.1. Đặt vấn đề .1

1.2. Mục đích – yêu cầu đề tài .2

1.2.1. Mục đích .2

1.2.2. Yêu cầu .2

1.3. Giới hạn đề tài .2

CHưƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Giới thiệu về cây hoa lan .3

2.1.1. Nguồn gốc và phân bố các loài phong lan. 3

2.1.2. Các đặc tính chủ yếu của loài lan ký sinh .4

2.1.3. Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium .7

2.1.3.1. Đặc điểm hình thái 8

2.1.3.2. Điều kiện sinh thái 9

2.1.4. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 9

2.1.4.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới 9

2.1.4.2. Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam 10

2.2. Giới thiệu về đa dạng sinh học 12

2.2.1. Định nghĩa 12

2.2.2. Các phân mức về đa dạng sinh học 12

2.2.2.1. Sự đa dạng về hình thái .12

2.2.2.2. Đa dạng loài 12

2.2.2.3. Sự đa dạng về di truyền .13

2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 14

2.3.1. Phương pháp sử dụng các marker hình thái .14

2.3.2. Phương pháp sử dụng các marker isozyme 14

2.3.3. Phương pháp sử dụng các marker phân tử .15

2.4. Quy trình ly trích DNA tế bào thực vật .15

2.5. Kỹ thuật PCR 17

2.5.1. Khái niệm và nguyên tắc của kỹ thuật PCR .17

2.5.2. Thành phần phản ứng PCR 19

2.5.3. ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR 20

2.6. Một số marker phân tử thường dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền .21

2.6.1. Marker RFLP .22

2.6.2. Marker AFLP .22

2.6.3. Marker RAPD 23

2.6.4. Marker SSR 25

2.7. Cây phát sinh loài 26

2.7.1. Một số thuật ngữ 26

2.7.2. Những cách vẽ cây phát sinh loài 26

2.7.3. Các phương pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài .27

2.8. Các công trình nghiên cứu khoa học có liên quan 27

2.8.1. Tình hình nghiên cứu khoa học trên cây lan ngoài nước .27

2.8.2. Tình hình nghiên cứu khoa học trên cây lan trong nước .28

CHưƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 30

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 30

3.2. Vật liệu 30

3.2.1. Các loài lan rừng giống Dendrobium .30

3.2.2. Hóa chất thí nghiệm .34

3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm 35

3.3. Phương pháp 36

3.3.1. Quy trình ly trích DNA tổng số .36

3.3.2. Kiểm tra định tính và định lượng DNA .37

3.3.2.1. Định tính DNA bằng phương pháp điện di .37

3.3.2.2. Định lượng DNA bằng phương pháp đo OD 38

3.3.3. Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR với marker RAPD 38

3.3.4. Thực hiện phản ứng PCR với marker RAPD .42

3.3.5. Phương pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS .43

3.3.6. Phân tích Boostrap bằng phần mềm Winboot 44

CHưƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .45

4.1. Sản phẩm ly trích DNA tổng số 45

4.2. Hoàn thiện quy trình PCR với marker RAPD .48

4.3. Đánh giá đa dạng di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium

thu thập tại tỉnh Bình Phước và thị xã Bảo Lộc tỉnh Lâm Đồng .52

4.3.1. Sản phẩm PCR với marker RAPD .52

4.3.2. Phân tích nhóm của 10 loài lan rừng giống Dendrobium

dựa trên dữ liệu RAPD .58

CHưƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .65

5.1. Kết luận .65

5.2. Đề nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 3.1 Danh sách các loài lan rừng giống Dendrobium nghiên cứu .30

Bảng 3.2 Danh sách các primer dùng trong nghiên cứu 35

Bảng 3.3 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR 38

Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR .39

Bảng 3.5 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của số chu kỳ đến sản phẩm RAPD 39

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR dùng trong thí nghiệm 1 .40

Bảng 3.7 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ primer đến sản phẩm

RAPD .40

Bảng 3.8 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm

RAPD .41

Bảng 3.9 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Taqđến sản phẩm

RAPD .41

Bảng 3.10 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ DNA mẫu đến

sản phẩm RAPD .42

Bảng 3.11 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dNTPs đến sản phẩm

RAPD .42

Bảng 4.1 OD của 20 mẫu dùng để thực hiện phản ứng PCR với marker RAPD 47

Bảng 4.2 Nồng độ tối ưu các thành phần của phản ứng PCR 52

Bảng 4.3 Chương trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR 52

Bảng 4.4 Danh sách các primer được sử dụng để nghiên cứu đa dạng

di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium .53

Bảng 4.5 Hệ số tương đồng di truyền của các loài lan rừng giống

Dendrobium khảo sát .58

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR 18

Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD 24

Hình 3.1 Các loài lan rừng giống Dendrobium nghiên cứu .33

Hình 4.1 DNA tổng số của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở Bảo Lộc .46

Hình 4.2 DNA tổng số của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở Bình Phước 46

Hình 4.3 Khảo sát ảnh hưởng của số chu kỳ 49

Hình 4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ primer 49

Hình 4.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ .50

Hình 4.6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Taq .50

Hình 4.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ DNA mẫu 51

Hình 4.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dNTPs 51

Hình 4.9 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 10 mẫu lan thu thập ở

Bảo Lộc (hình a) và Bình Phước (hình b) 55

Hình 4.10 Sản phẩm PCR với primer OPB01 của 10 mẫu lan thu thập ở

Bảo Lộc (hình a) và Bình Phước (hình b) 56

Hình 4.11 Sản phẩm PCR với primer S1384 của 10 mẫu lan thu thập ở

Bảo Lộc (hình a) và Bình Phước (hình b) 57

Hình 4.12 Cây phân nhóm di truyền giữa 10 loài lan rừng giống

Dendrobium thu thập tại tỉnh Bình Phước và thị xã Bảo Lộc 60

Hình 4.13 Đồ thị phân bố nhóm dựa trên dữ liệu RAPD .6