MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 5

Chương 1 – TỔNG QUAN 7

1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi 7

1.1.1. Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan 7

1.1.2. Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi 9

1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen 10

1.2.1. Giới thiệu về nấm mốc 10

1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm 12

1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens 17

1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger 17

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1. Nguyên liệu 24

2.1.1. Nguyên liệu 24

2.1.2. Hóa chất 24

2.1.3. Thiết bị 26

2.2. Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen 26

2.2.2. Biến nạp vào tế bào E. coli và A. tumefaciens 30

2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 32

2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 33

2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ 34

2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 36

2.2.7. Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 37

2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger 38

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1.1. Lắp ghép xylB vào vector trung gian 44

3.1.2. Lắp ghép cấu trúc biểu hiện hph vào vector trung gian 50

3.1.3. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian (pKS_xylB_hph) 56

3.2. Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph 57

3.2.1. Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian vào Ti plasmid 57

3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid 58

3.3. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph 62

3.3.1. Biến nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A. tumefaciens 62

3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong Agrobacterium 62

3.4. Kết quả chuyển vector biểu hiện xylB và hph vào A. niger thông qua A. tumefaciens 64

3.4.1. Kết quả nuôi nhiễm 64

3.4.2. Chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường kháng sinh 67

KẾT LUẬN 69

KIẾN NGHỊ 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71