Đề tài: Phân lập và biểu hiện gen fljB mã hoá kháng nguyên roi H: 1,2 của Salmonella typhimurium trong Escherichia coli BL21

mục lục

Lời nói đầu 1

Chương 1: Tổng quan về tài liệu 3

1.1 Khái quát chung về Salmonella 3

1.1.1. Tình hình dịch bệnh do Salmonella 3

1.1.2. Một số đặc điểm vi sinh của Salmonella 4

1.1.3. Phân loại Salmonella 4

1.1.4. Bệnh học của sự lây nhiễm Salmonella 5

1.1.5. Sự đề kháng của Salmonella với các chất kháng sinh 6

1.2. Kháng nguyên của Salmonella 8

1.2.1. Đặc điểm chung về kháng nguyên của Salmonella 7

1.2.1.1. Kháng nguyên thân 8

1.2.1.2. Kháng nguyên tua riềm 8

1.2.1.3. Kháng nguyên roi H 8

1.2.1.3.1.Cấu trúc protein flagellin của Salmonella 9

1.2.1.3.2. Quá trình hình thành flagella trong Salmonella 10

1.2.1.3.3 Cơ chế điều hoà biểu hiện protein roi (H) ở vi khuẩn Salmonella typhimurium 12

1.2.2. Vai trò kháng nguyên H trong đáp ứng miễn dịch bảo hộ phòng chống salmonella 14

1.3. Vacxin 16

1.3.1. Khái quát về vacxin 16

1.3.2. Phân loại vacxin 18

1.4. Phân lập và biểu hiện gen 24

1.4.1. Phân lập gen 24

1.4.1.1. Phân lập gen từ ngân hàng gen 24

1.4.1.2. Phân lập gen bằng kỹ thuật pCR 24

1.4.2. Biểu hiện gen 25

1.4.2.1.Hệ biểu hiện gen trong E. coli BL21 25

1.4.2.2. Hệ vector biểu hiện pET32a(+) 25

1.4.2.3. Chủng biểu hiện E. coli BL21 26

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 28

2.1. Nguyên liệu 28

2.1.1. Chủng sinh vật 28

2.1.2. plasmit 28

2.1.3. Môi trường nuôi cấy 28

2.1.4. Các dung dịch sử dụng 28

2.1.5. Hoá chất, enzyme, thiết bị 29

2.2. Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn 30

2.2.2 Khuếch đại gen fljB bằng kỹ thuật PCR 31

2.2.3. Xử lý ADN bằng enzim hạn chế 31

2.2.4. Quá trình tinh sạch ADN từ gel agaroza bằng cột QUIAGEN 32

2.2.5. Phản ứng nối ghép gen ngoại lai vào plasmit 32

2.2.6. Biến nạp sản phẩm ghép gen vào E. coli bằng sốc nhiệt 33

2.2.7. Tách chiết AND plasmit từ E. coli 34

2.2.8. Cảm ứng, biểu hiện protein tái tổ hợp 35

2.2.9. Phương pháp điện di ADN trên gel agaroza 36

2.2.10. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamit 12,6% 37

2.2.11. Tinh sạch protein qua cột sắc ký ái lực His-tag 37

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 39

3.1. Tách chiết ADN hệ gen của S. typhimurium 41

3.2. Khuếch đại gen fljB bằng kỹ thuật PCR 42

3.3. Tách dòng gen fljB 44

3.3.1. Đưa gen fljB vào véc tơ tách dòng PCR 2.1 44

3.3.1.1.Biến nạp sản phẩm nối ghép gen vào tế bào E. coli DH5ỏ 45

3.3.1.2. Chọn lọc các cá thể mang plasmit tái tổ hợp 46

3.3.2. Cắt kiểm tra plasmit tái tổ hợp PCRfljB 47

3.3.3.kiểm tra gen fljB trong pCR2.1 bằng giải trình tự gen 50

3.4. Thiết kế vectơ biểu hiện mang gen fljB 51

3.4.1. Thu gen fljB từ plasmit tái tổ hợp pCRfljB 51

3.4.2. Phản ứng nối ghép fljB và véc tơ pET32a (+) 51

3.4.3. Chọn lọc thể biến nạp mang plasmit tái tổ hợp 51

3.4.4. Cắt kiểm tra plasmit tái tổ hợp pET32fljB 52

3.5. Biểu hiện gen fljB trong E.coli BL21 54

3.6. Nghiên cứu một số điều kiện thích hợp để tối ưu biểu hiện protein tái tổ hợp fljB của E. coli 55

3.6.1. Nhiệt độ cảm ứng ảnh hưởng lên khả năng biểu hiện gen fljB 55

3.6.2. Nồng độ cảm ứng IPTG ảnh hưởng lên khả năng biểu hiện gen fljB 59

3.6.3. Thời gian cảm ứng ảnh hưởng lên khả năng biểu hiện gen fljB 60

3.7. Tinh sạch protein tái tổ hợp FljB 61

Kết luận 64

Định hướng nghiên cứu 64

Tài liệu tham khảo 6