MỞ ĐẦU

Trong nhiều năm gần đây, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng, đặc biệt là enzyme xylanase. Xylanase được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất công nghiệp trên toàn thế giới [18, 29]. Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi có tác dụng thúc đẩy quá trình tiêu hóa, từ đó cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của động vật [4, 13]. Ngoài ra, xylanase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác ví dụ: phân hủy rác thải; làm trắng trong công nghiệp sản xuất giấy [22, 29].

Trong tự nhiên, rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc tiết ra xylanase , trong đó xylanase do nấm mốc tiết ra được quan tâm hơn cả bởi chúng có hàm lượng cao và ổn định. Nấm mốc Aspergillus hay còn gọi là nấm sợi, là nhóm nấm đa dạng và phân bố rộng trong tự nhiên. Với tiềm năng vô cùng phong phú, Aspergillus được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất enzyme cũng như trong các ngành nghiên cứu cơ bản về cơ chế sinh lý và sinh hóa và cơ chế di truyền vi sinh vật từ nhiều năm nay trên thế giới [9, 11].

Do nhu cầu sử dụng xylanase trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực sản xuất thức ăn chăn nuôi ngày càng tăng. Bởi vậy, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng enzyme xylanase có chất lượng cao, ổn định từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhờ công nghệ chuyển gen đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu [22, 31]. Chuyển gen vào nấm dựa trên nền tảng của công nghệ DNA tái tổ hợp, để cải biến hệ gen của nấm mốc nhằm đáp ứng nhu cầu của con người về các sản phẩm protein cũng như enzyme để sản xuất trên qui mô công nghiệp. Hơn nữa, kỹ thuật chuyển gen cho phép chọn lựa promoter đặc hiệu cũng như các chủng vi sinh vật chuyển gen mong muốn, nhờ vậy đặc tính của enzyme tái tổ hợp đã được cải thiện .

Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng phổ biến trên thế giới để chuyển gen vào thực vật. Bởi đây là một hệ thống chuyển gen có hiệu suất cao, ổn định và đơn giản. Agrobacterium đã và đang được nghiên cứu, áp dụng để chuyển gen vào nấm mốc [3, 9].

Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc”

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài

Mục tiêu

Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ chuyển gen để thiết kế Ti–plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B. Trên cở sở đó tạo các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp phục vụ công tác chuyển gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào A. niger.

Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế vector tách dòng trung gian pKS_xylB_hph dựa trên vector pBluescript II KS (-) mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B:(GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator).

- Thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph dựa trên vector pCAMBIA1300 mang hai cấu trúc biểu hiện biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B: (GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator.

- Tạo các chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm mốc.

- Chuyển vector biểu hiện pCB_xylB_hph vào nấm mốc A. niger thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 5

Chương 1 – TỔNG QUAN 7

1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi 7

1.1.1. Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan 7

1.1.2. Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi 9

1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen 10

1.2.1. Giới thiệu về nấm mốc 10

1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm 12

1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens 17

1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger 17

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1. Nguyên liệu 24

2.1.1. Nguyên liệu 24

2.1.2. Hóa chất 24

2.1.3. Thiết bị 26

2.2. Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen 26

2.2.2. Biến nạp vào tế bào E. coli và A. tumefaciens 30

2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 32

2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 33

2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ 34

2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 36

2.2.7. Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 37

2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger 38

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1.1. Lắp ghép xylB vào vector trung gian 44

3.1.2. Lắp ghép cấu trúc biểu hiện hph vào vector trung gian 50

3.1.3. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian (pKS_xylB_hph) 56

3.2. Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph 57

3.2.1. Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian vào Ti plasmid 57

3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid 58

3.3. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph 62

3.3.1. Biến nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A. tumefaciens 62

3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong Agrobacterium 62

3.4. Kết quả chuyển vector biểu hiện xylB và hph vào A. niger thông qua A. tumefaciens 64

3.4.1. Kết quả nuôi nhiễm 64

3.4.2. Chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường kháng sinh 67

KẾT LUẬN 69

KIẾN NGHỊ 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

AS Acetosyringone

ATP Adenosine triphosphate

bp Base pair

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

EtBr Ethidium bromide

xylB Xylanase B

Hph Hygromycin photpotransferase encoding gene

IM Induction medium

kb Kilo base

kDa Kilo Dalton

LB Luria – Bertani

LC Luria – Complete

MES (2 – N – morpholine) – ethane sulfonic acid

PCR Polymerase Chain Reaction

RNase Ribonuclease

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

TAE Tris – acetate – EDTA

vir Virulence regio