[TD="colspan: 3"]NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP

[TD="width: 96%, colspan: 3"]

[TD="width: 96%, colspan: 3"] HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG

[TD="width: 79%, colspan: 2"] Trang nhan đề

[TD="width: 19%"] http://www.nsl.hcmus.edu.vn/greenstone/collect/tiensifu/import/231111/Sinh/HoangVanQuocChuong/HoangVanQuocChuong.jpg

[TD="width: 79%, colspan: 2"] Lời cảm ơn

[TD="width: 79%, colspan: 2"] Mục lục

[TD="width: 79%, colspan: 2"] Một số từ viết tắt

[TD="width: 79%, colspan: 2"] Đặt vấn đề

[TD="width: 20%"] Chương 1:

[TD="width: 55%"]Tổng quan

[TD="width: 20%"] Chương 2:

[TD="width: 55%"]Vật liệu, phương pháp

[TD="width: 20%"] Chương 3:

[TD="width: 55%"]Kết quả- biện luận

[TD="colspan: 3"] Kết luận & kiến nghị

[TD="colspan: 3"] Danh mục các công trình

[TD="colspan: 3"] Tài liệu tham khảo

[TD="colspan: 3"] Phụ lục

?ĐẶT VẤN ĐỀ

“Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa

mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này của

nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang

trở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO,

2008) , hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu

đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5%

dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một

người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái

tháo đường bị cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do

biến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên

quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS .

Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xã

hội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trị bệnh,

nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí khổng lồ về kinh tế có

thể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tật

gây ra. Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từ

lớp trẻ .

Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớn

tỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000. Số

người mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành

nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới .

Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hoặc do cơ thể người bệnh

kháng insulin. Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào ß

của tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu. Phương

Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề

-2-

pháp điều trị BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin định kỳ cho người bệnh. Do

số lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn. Ở

châu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007. Theo

ước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong nam 2007

lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thị trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ

kim .

Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học

Genetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu

hiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản

xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin

đã được FDA (Food & Drug Administration - Cơ quan Quản lý thuốc và thực

phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên

thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis với

nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện nay

thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide

và phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp

bằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản. Đầu tiên là

bước tạo dòng chủng chủ (thường là E. coli) có khả năng mang gen ngoại tổng

hợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin). Đây là khâu then chốt quyết định

sự thành công của công nghệ do cần phải biến đổi các codon thích hợp để tăng

cường hiệu quả biểu hiện. Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu

nhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin. Protein được biểu hiện dưới dạng

thể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần phải biến tính để làm tan, sau đó tiến

hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộn

được xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu

insulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide,

Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề

-3-

trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2

chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B). Sau đó tinh chế thu nhận các

chuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu

nhận insulin có hoạt tính.

Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồn

insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốn

kém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trị kịp thời

cho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trị toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày

với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày , thì Việt Nam

cần phải nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg

insulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin

tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển

trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui

trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần

giải quyết khó khăn trên.

Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã

hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công

nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình

công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng

qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công

nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầu

đặt ra.

Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành

phố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên

cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trị bệnh đái tháo đường”, mã số

Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề

-4-

KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong

nội dung của đề tài cấp nhà nước này.

Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui

trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide

trong E. coli bao gồm tạo dòng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên

men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính. Ý nghĩa

thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công

nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trị bệnh

tiểu đường.

Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau:

- Tạo chủng E. coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái

tổ hợp của người.

- Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện

mini-proinsulin.

- Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủng

E. coli.

- Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulin

có hoạt tính.

- Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột