[FONT="]MỤC LỤC

Trang

[FONT="]LỜI CẢM ƠN iii

[FONT="]TÓM TẮT . iv

[FONT="]MỤC LỤC . .v

[FONT="]DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . viii

[FONT="]DANH MỤC CÁC HÌNH .xi

[FONT="]DANH MỤC CÁC BẢNG xii

[FONT="]DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ xiii

[FONT="]DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ .xiv

[FONT="]PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

[FONT="]1.1. Mở đầu 1

[FONT="]1.2. Mục tiêu và yêu cầu . 1

1.2.1. Mục tiêu 1

1.2.2. Yêu cầu .2

[FONT="]PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

[FONT="]2.1. Kháng nguyên .3

[FONT="]2.2. Kháng thể 3

2.2.1. Chuỗi nhẹ (L) 4

2.2.2. Chuỗi nặng (H) .4

[FONT="]2.3. Đáp ứng miễn dịch .5

2.3.1. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu .6

2.3.2. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo 6

2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch .7

[FONT="]2.4. Cơ chế miễn dịch dịch thể . 10

[FONT="]2.5. Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB . 15

[FONT="]2.6. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two

[FONT="]dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) 15

2.6.1. Sự kết hợp giữa kháng nguyên - kháng thể . 15

2.6.2. Phản ứng kết tủa theo kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch (Double

diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) 17

2.7. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero . 18

2.7.1. Sơ lược về tế bào vero . 18

2.7.2. Độc tố VT2e 19

2.7.3. Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố

trên môi trường tế bào vero . 20

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 21

3.1. Thời gian và địa điểm . .21

3.2. Nội dung nghiên cứu . .21

3.3. Vật liệu và hoá chất 21

3.3.1. Thú thí nghiệm . .21

3.3.2. Vật liệu và hoá chất 21

3.3.3. Môi trường .22

3.3.4. Thiết bị và dụng cụ 22

3.4. Phương pháp nghiên cứu . 22

3.4.1. Bố trí thí nghiệm .22

3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm .24

3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh . .24

3.4.4. Xử lý kháng huyết thanh .24

3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S 24

3.4.4.2. Hòa tan kháng thể .25

3.5. Đánh giá . .27

3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật

Ouchterlony) 27

3.5.2. Định lượng: phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường

tế bào vero . 28

3.5.2.1. Xác định liều TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50) .28

3.5.2.2. Thử phản ứng trung hoà độc tố . . 31

3.6. Chỉ tiêu theo dõi . 33

3.7. Đánh giá kết quả và xử lý số liệu 33

PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34

4.1. Xác định kháng thể đặc hiệu với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB bằng kỹ

thuật Ouchterlony 34

4.1.1. Xác định quy trình thực hiện phản ứng . 34

4.1.2. Đánh giá kết quả gây miễn dịch theo các quy trình

ngắn ngày và dài ngày 35

4.1.2.1. Quy trình ngắn ngày 35

4.1.2.2. Quy trình dài ngày .36

4.1.3. Nhận xét . .38

4.2. Xác định liều TCID50 .41

4.3. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 42

4.3.1. Kiểm tra độ an toàn của kháng huyết thanh đối với tế bào vero . 42

4.3.1.1. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và tế bào vero 43

4.3.1.2. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và có bất hoạt 43

4.3.1.3. Thí nghiệm đánh giá tác động của NaN3 . 44

4.3.1.4. Kháng huyết thanh không bổ sung NaN3 và có bất hoạt . 44

4.3.2. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero .46

4.3.2.1. Quy trình dài ngày .47

4.3.2.2. Quy trình ngắn ngày .50

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .53

PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC .56

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.1. MỞ ĐẦU

Độc tố verotoxin VT2eB do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta. Vì vậy, các nghiên cứu giúp phòng bệnh, phát hiện, giám sát các tác nhân gây bệnh là vấn đề đang nhận được sự quan tâm hàng đầu.

Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh tiêu chảy và phù đầu ở heo con tuy có

hiệu quả nhưng gây nhiều triệu chứng phụ, như rối loạn tiêu hoá, không có chức năng

phòng bệnh và tạo ra những chủng vi sinh vật kháng kháng sinh (gây khó khăn cho

việc trị bệnh lâu dài). Để khắc phục những khó khăn trên, phương pháp dùng vaccin để

phòng ngừa bệnh cho heo hứa hẹn mang lại hiệu quả hơn. Tuy nhiên, hầu hết các loại

vaccin hiện nay được sản xuất theo phương pháp cổ điển bằng cách sử dụng vi khuẩn

chết hay vi khuẩn nhược độc nên tính đặc hiệu không cao và gây một số phản ứng phụ

có hại. Phương pháp này gặp một số bất lợi như hiện tượng phục hồi một số tính độc

ban đầu hay sự phân huỷ không hoàn toàn các độc tố, dễ dẫn đến các hiệu ứng không

mong muốn ở các con thú được tiêm chủng. Hơn nữa, việc sử dụng vi khuẩn chết lại

đòi hỏi phải tiêm lập lại nhiều lần, vì tính gây đáp ứng miễn dịch không cao.

Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra được chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được protein này. Từ thực tế đó, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, với sự hướng dẫn của TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ”.

1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU

1.2.1. Mục tiêu

Đánh giá hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ nhằm xác định khả năng ứng dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù do E. coli gây ra trên heo.

1.2.2. Yêu cầu

ƒ Thu nhận kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.

ƒ Xác định sự hiện diện của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. ƒ Thử khả năng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero