MỤC LỤC

Trang

Lời cảm tạ--------------------------------------------------------------------------------iii

Tóm tắt khoá luận-----------------------------------------------------------------------iv

Abstract ---------------------------------------------------------------------------------- v

Mục lục-----------------------------------------------------------------------------------vi

Danh sách các chữ viết tắt ------------------------------------------------------------viii

Danh sách các bảng--------------------------------------------------------------------- x

Danh sách các hình --------------------------------------------------------------------- x

Chương 1. MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------- 1

1.1. Đặt vấn đề---------------------------------------------------------------------- 1

1.2. Mục đích và yêu cầu---------------------------------------------------------- 2

1.2.1. Mục đích --------------------------------------------------------------------- 2

1.2.2. Yêu cầu----------------------------------------------------------------------- 3

Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ------------------------------------------------ 4

Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM -------------------- 7

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận -------------------------------- 7

3.2. Vật liệu ------------------------------------------------------------------------- 7

3.3. Phương pháp thí nghiệm ----------------------------------------------------- 8

3.2.1. Cấu trúc gen ----------------------------------------------------------------- 8

3.2.1.1. Tiểu đơn vị epsilon ( ) của F F -ATP synthase----------------------- 8

0 1

3.2.1.2. Protein huỳnh quang màu vàng (Venus)------------------------------- 9

3.2.1.3. Cấu trúc chung của các ATeam ---------------------------------------- 10

3.2.1.4. Nhóm ATeam với EF1 ------------------------------------------------- 12

3.2.1.5. Nhóm ATeam với BME ----------------------------------------------- 13

3.2.1.6. Nhóm ATeam với BCL ----------------------------------------------- 14

3.2.1.7. ATeam BPF -nVenus---------------------------------------------------- 16

3.2.2. Kiểm tra cấu trúc của các ATeam---------------------------------------- 16

3.2.2.1. Nhóm ATeam với monomeric Venus (nVenus) ---------------------- 16

3.2.2.2. Nhóm ATeam với cpVenus --------------------------------------------- 18

3.2.3. Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp ------------------------------- 18

3.2.4. Đánh giá các ATeam in vitro --------------------------------------------- 21

3.2.4.1. Đo quang phổ huỳnh quang của ATeam------------------------------ 20

3.2.4.2. Đo timecourse của ATeam---------------------------------------------- 22

3.2.4.3. Công thức tính dynamic range----------------------------------------- 22

3.2.4.4. Công thức tính hằng số phân ly --------------------------------------- 22

3.2.4.5. Công thức tính tốc độ đáp ứng với ATP của ATeam ---------------- 23

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ------------------------------------------ 24

4.1. Kết quả thí nghiệm----------------------------------------------------------- 24

4.1.1. Nhóm ATeam EF1 -nVenus và ATeam EF1 -cpVenus --------------- 24

4.1.2. Kết quả sắc ký lọc gel của ATeam BME-nVenus,

BCL-nVenus, BPF-nVenus ----------------------------------------------- 26

4.1.3. Nhóm ATeam BME-nVenus và ATeam BME-cpVenus--------------- 27

4.1.5. ATeam BPF-nVenus ------------------------------------------------------- 32

4.1.6. Nhóm ATeam với BCL -------------------------------------------------- 33

4.2. Thảo luận---------------------------------------------------------------------- 42

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ --------------------------------------------- 45

Chương 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ---------------------------------------------- 48

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 4.1 Bảng so sánh dynamic range của nhóm ATeam EF1-nVenus

và ATeam EF1-cpVenus ------------------------------------------------- 24

Bảng 4.2 Bảng so sánh dynamic range của nhóm ATeam BME-nVenus

và ATeam BME-cpVenus ------------------------------------------------ 29

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc của Cameleons và hiệu ứng FRET giữa

hai phân tử GFP khi Ca2+ kết hợp vào calmodulin --------------------- 5

Hình 3.1 A. Sơ đồ cấu trúc của ATP synthase -------------------------------------- 9

B. Cấu trúc tinh thể của TF - khi gắn với ATP

1

Hình 3.2 Cấu trúc tinh thể của monomeric Venus--------------------------------- 10

Hình 3.3 Sơ đồ cấu trúc chung của các ATeam với nVenus và cp Venus ------ 11

Hình 3.4 Sơ đồ vector pCEV1-EF -------------------------------------------------- 12

1

Hình 3.5 Sơ đồ vector pRSET-AT1.20---------------------------------------------- 13

Hình 3.6 Các mồi được thiết kế để gây đột biến gen BCL -------------------- 17

Hình 3.7 Nuôi cấy E.coli XL10 trên môi trường thạch LB,

0.1 mg/ml Ampicillin------------------------------------------------------ 17

Hình 3.8 Kết quả điện di trên gel agarose của pRSET-BCL

(I9T/V42K/F67N/L78N)- cpVenus, cắt bởi ClaI và PstI. ------------- 18

Hình 3.9 Nuôi cấy E.coli JM109 (DE3) trên môi trường thạch LB,

0.1 mg/ml Ampicillin------------------------------------------------------ 20

Hình 3.10 Protein ATeam thu được sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel----- 21

Hình 4.1 Quang phổ huỳnh quang của nhóm ATeam với EF1 ở các

nồng độ khác nhau của ATP---------------------------------------------- 25

Hình 4.2 So sánh kết quả sắc ký lọc gel của ATeam BME-nVenus,

ATeam BCL-nVenus, ATeam BPF-nVneus ---------------------------- 27

Hình 4.3 Kết quả Native-PAGE của ATeam BCL-nVenus và

ATeam BPF-nVenus ------------------------------------------------------- 28

Hình 4.4 Kết quả sắc ký lọc gel của BCL-nVenus (1)

và BCL-nVenus (2) -------------------------------------------------------- 28

Hình 4.5 Quang phổ huỳnh quang của nhóm ATeam với BME ở

những nồng độ khác nhau của MgATP --------------------------------- 30

Hình 4.6 Kết quả đo time-course của ATeam BME-cp173Venus ở

các nồng độ xác định của MgATP--------------------------------------- 31

Hình 4.7 Đường cong chuẩn độ với MgATP của ATeam BME-cp173Venus-- 32

Hình 4.8 Quang phổ huỳnh quang của ATeam BPF-nVenus--------------------- 33

Hình 4.9 Quang phổ huỳnh quang của ATeam BCL-nVenus -------------------- 34

Hình 4.10 Đường cong chuẩn độ với MgATP của ATeam BCL-nVenus------- 34

Hình 4.11 So sánh đường cong chuẩn độ với MgATP của

ATeam BCL-nVenus (1) và BCL-nVenus (2) ------------------------ 3