TÓM TẮT

NGÔ QUANG HưỞNG, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh,

tháng 8/2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora

cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis

Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dương) bằng kỹ thuật RFLP –

PCR”.

Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến

ThS. Phan Thành Dũng

Thời gian thực hiện từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006, tại Viện Nghiên Cứu

Cây Cao Su Việt Nam, Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương và tại Trung tâm Phân

tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

Vấn đề bảo vệ thực vật luôn nhận được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội.

Đối với một nước sản xuất cao su thiên nhiên như Việt Nam, những nghiên cứu

về vi sinh vật, côn trùng, sâu hại trên cây cao su là vô cùng cấp thiết. Bệnh rụng

lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra là một bệnh mới và vô

cùng nguy hiểm. Nó gây ra những thiệt hại rất lớn về kinh tế. Để tạo những tiền

đề cho các nghiên cứu về loại bệnh này, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP

– PCR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể nấm C. cassiicola tại

Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương.

Nôi dung nghiên cứu:

- Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Corynespora cassiicola.

- Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS bằng 2 primer ITS A và

ITS B.

- Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR thu được.

Các kết quả đạt được:

- Phân lập được 65 dòng nấm và tách đ

C. cassiicolai trên các dòng vô tính cao su khác nhau.

- Dùng PCR khuếch đại được vùng gene nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S

và đầu 5’ của rDNA 28S, với kích thước là 540 bp.

- Phân cắt sản phẩm PCR với 7 loại enzyme cắt là Hae III, Sau3A I,

EcoR I, Nde II, Cfo I, Rsa I, Alu I. Kết quả là không tìm thấy băng đa hình khi

cắt bằng 7 loại enzyme trên.

Việc sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa dạng di truyền nấm

C. cassiicola chưa cho kết quả như mong muốn. Không tìm thấy bất cứ sự

khác biệt nào khi phân cắt bằng 7 loại enzyme trên. Do đó, cần có những

nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự để có những kết luận chính xác về mức

độ đa dạng di truyền của quần thể nấm này.

MỤC LỤC

PHẦN TRANG

Trang tựa

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt . iv

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các bảng xi

Danh sách các hình .xii

1. MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục đích – Yêu cầu . 2

1.2.1. Mục đích . 2

1.2.2. Yêu cầu . 2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg . 3

2.1.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg

trên thế giới và tại Việt Nam . 3

2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng mưa, tốc độ gió đến

sự phát triển của cây cao su . 4

2.1.3. Tình hình bệnh hại trên cây cao su 5

2.2. Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei . 6

2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm

Corynespora cassiicola (Berk. & Curt. ) Wei . 6

2.2.2. Đặc điểm phân loại học của nấm

Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei . 6

2.2.3. Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm

Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei . 7

2.2.4. Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố và triệu chứng

của bệnh rụng lá Corynespora 8

2.2.5. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nước trồng nhiều

cao su trên thế giới . 9

2.3. Giới thiệu về phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 10

2.3.1. Sơ lược về kỹ thuật PCR 10

2.3.2. Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng

đến kết quả phản ứng PCR . 10

2.3.3.1. DNA mẫu . 10

2.3.3.2. Primer và nhiệt độ lai . 11

2.3.3.3. Enzyme . 12

2+

2.3.3.4. Mg . 12

2.3.3.5. dNTPs . 12

2.3.3.6. Số lượng chu kỳ . 12

2.3.3.7. Nhiệt độ và pH . 13

2.3.3.8. Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR 13

2.3.4. Các bước thực hiện một phản ứng PCR . 13

2.3.5. Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR . 14

2.3.6. Ứng dụng của kỹ thuật PCR . 14

2.4. Giới thiệu về kỹ thuật RFLP 15

2.4.1. Sơ lược về enzyme cắt giới hạn . 15

2.4.1.1. Giới thiệu chung . 15

2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn 15

2.4.1.3. Các loại RE 16

2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE . 17

2.4.2. Sơ lược về phương pháp RFLP (Restriction Fragment

Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) . 17

2.4.2.1. Giới thiệu chung . 17

2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP 17

2.4.2.3. Sơ lược về kỹ thuật RFLP – PCR 18

2.6. Giới thiệu về vùng ITS . 19

2.7. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora

cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nước và ngoài nước . 20

3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP 22

3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 22

3.1.1. Thời gian . 22

3.1.2. Địa điểm 22

3.1.3. Đối tượng nghiên cứu . 22

3.2. Nội dung nghiên cứu 22

3.3. Vật liệu và phương pháp 22

3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối 22

3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 22

3.3.1.2. Phương pháp lấy mẫu . 23

3.3.1.3. Phương pháp phân lập nấm 23

3.3.1.4. Phương pháp tách đơn bào tử . 23

3.3.1.5. Phương pháp nhân sinh khối 24

3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA của nấm . 24

3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm . 24

3.3.2.2. Phương pháp tách chiết DNA 24

3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di 25

3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích . 25

3.3.2. Khuếch đại vùng ITS của nấm

Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei bằng kỹ thuật PCR . 26

3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm . 26

3.3.2.2. Thực hiện phản ứng PCR . 26

3.3.2.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di . 27

3.3.3. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm

Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei . 28

3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 28

3.3.3.2. Thực hiện phân tích RFLP 28

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola

trên một số dòng vô tính cao su . 29

4.1.1. Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây

bệnh rụng lá Corynespora . 29

4.1.2. Kết quả phân lập 32

4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử . 32

4.1.4. Kết quả nhân sinh khối 35

4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm . 36

4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR 37

4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola 40

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 46

5.1. Kết luận 46

5.2. Đề nghị . 46

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

7. PHỤ LỤC . 5