[FONT=Times New Roman]MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học hiện đại sử dụng kỹ thuật di truyền đã đóng góp đáng

kể trong việc cải tạo năng suất chất lượng cây trồng. Hiện nay có rất nhiều cây

trồng là sản phẩm của công nghệ sinh học được thương mại trên thế giới đã

khẳng định tiềm năng và khả năng phát triển của lĩnh vực này. Trong các kỹ

thuật ứng dụng công nghệ sinh học vào nâng cao năng suất, chất lượng giống

cây không thể không kể đến kỹ thuật chuyển gen thực vật.

Ngày nay kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng rộng rãi trong việc

chuyển các gen hữu ích vào cây trồng tạo ra các cây trồng có nhiều ưu điểm

vượt trội hơn hẳn so với loài ban đầu. Trong khoảng thời gian từ năm 1996 đến

năm 2005, tỷ lệ diện tích trồng cây chuyển gen ở các nước đang phát triển đều

tăng hàng năm, từ 1,7 triệu hecta (1996) lên 90 triệu hecta (2005) chiếm hơn 1/3

diện tích đất trồng cây nông nghiệp. Điều này cho thấy ngày càng có nhiều nông

dân tại các nước phát triển và đang phát triển chấp nhận và trồng cây chuyển

gen. Số nước trồng cây biến đổi gen đã tăng gấp 3 lần trong vòng 9 năm (từ 6

nước năm 1996 đến 21 nước năm 2005) (James, 2007).

Kỹ thuật chuyển gen thực vật cho phép đưa một hoặc nhiều gen có đặc

điểm ưu việt từ những loài có thể rất khác nhau về di truyền vào bộ gen của cây

nhận trong một thời gian ngắn. Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật

đã được thử nghiệm tuy nhiên hiện nay 2 phương pháp được sử dụng rộng rãi

hơn cả là chuyển gen bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefacien. Chuyển gen thông qua vi khuẩn có ưu điểm

dễ tiến hành, khả năng chuyển nạp cao và tiết kiệm chi phí vì vậy nó được tiến

hành ở hầu khắp các phòng thí nghiệm. Có nhiều quy trình chuyển gen đã được

xây dựng cho rất nhiều các loại cây trồng khác nhau như thuốc lá, cà chua, khoai

tây, mía, sắn… Một quy trình chuyển gen thực vật bao gồm các bước chính sau:

(1) Phân lập gen mong muốn từ một sinh vật bất kỳ; (2) Tạo dòng và thiết kế

vector chuyển gen mang đoạn gen mong muốn đó; (3) Biến nạp vector chuyển

gen vào thực vật nhận và (4) Chọn lọc, phân tích biểu hiện của gen chuyển.

Chuyển gen được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được

dung hợp vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào

chủ; (iii) gen chuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau, trong mỗi thế hệ2

sản phẩm của gen chuyển cũng phải được biểu hiện; và (iv) sản phẩm biểu hiện

của gen chuyển phải thể hiện được chức năng sinh học. Chính vì vậy quá trình

chọn lọc, phân tích cây chuyển gen trong mỗi thế hệ có thể được thực hiện theo

ba nội dung sau:

(1) Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ (cây mang gen

chuyển);

(2) Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu

hiện là mRNA và protein;

(3) Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển.

Mỗi nội dung có các phương pháp, kỹ thuật phân tích tương ứng, phù hợp

và trong thực tiễn có thể tiến hành các phương pháp trong phòng thí nghiệm, nhà

lưới hoặc đồng ruộng. Qua các thế hệ, cần phân tích, đánh giá và xác định đặc

điểm di truyền của gen chuyển (sự di truyền, sự phân ly), phân tích đặc tính di

truyền của cây chuyển gen

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "Method for detection of specific

RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and

hybridization with DNA probes". Proc Natl Acad Sci USA 74 (12): 5350–

5365.

2. Angerer LM, Cox KH, Angerer RC (1987) Demonstration of

tissuespecific gene expression by in situ hybridization. Meth Enzymol

152: 649– 661.

3. Brasileiro ACM and Aragao FJL (2001) Marker genes for in vitro

selection of transgenic plants. Plant Biotech 3: 113–121.

4. Bubner B, Gase K, Baldwin IT (2004) Twofold differences are the

detection limit for determining transgene copy numbers in plants by realtime PCR. BMC Biotechnol 4:14

5. Carleton KL and Kocher TD (2001) Cone opsin genes of African cichlid

fishes: tuning spectral sensitivity by differential gene expression. Mol Biol

Evol 18: 1540–1550.

6. Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2008) Đánh giá ảnh

hưởng của mật độ huyền phù vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào cây

bông (Gossypium hirsutum L.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens.Tạp chí công nghệ sinh hoc số 6: 689-695

7. Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE (1999) Quantitative RT-PCR:

Pitfalls and potential. BioTechniques 26: 112–125.

8. Gause WC and Adamovicz J (1994) The use of PCR to quantitate geneexpression. PCR Methods Applicat. 3: S123–S135.

9. He KJ, Wang ZY, Zhang YJ (2009) Monitoring Bt resistance in the field:

China as a case study.In: Ferry N, Gatehouse AMR (eds) Environmental

impact of genetically modified/novel crops CAB International, Oxford,

UK, 344–360

10.Hu CY, Chee PP, Chesney RH, Zhou JH, Miller PD (1990) Intrinsic

GUS-like activities in seed plants. Plant Cell Rep 9: 1–5.

11.Ingham DJ, Beer S, Money S, Hansen G (2001) Quantitative realtime

PCR assay for determining transgene copy number in transformed plants.

Biotechniques 31:132–140.19

12.Inoue-Nagata A, Nagata T, de Avila AC, de BGordano L (2007) A

reliable egomovirus inoculation method for screening Lycopersicon

esculentum lines. Horticultura Brasileira 25: 447-450.

13.Jackson RE, Bradley JR Jr, Van Duyn JW (2004) Performance of feral

and Cry1Ac-selected Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) strains on

transgenic cottons expressing either one or two Bacillus thuringiensis ssp.

kurstaki proteins under greenhouse conditions. Entomol Sci 39:46–55

14.James C (2007) Global status of commercialized biotech/GM crops.

ISAAA Briefs 37, ISAAA

15.Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) β-Glucuronidase from

Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA 83:

8447–8451.

16.Jefferson RA, Kavanagh TA, and Bevan MW (1987) GUS fusions:

betaglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in

higher plants. Embo 6: 3901–3907.

17.Joersbo M and Okkels FT (1996) A novel principle for selection of

transgenic plant cells: positive selection. Plant Cell 16: 219–221.

18.Joersbo M, Donaldson I, Kreiberg J, Petersen SG, Brunstedt J, Okkels FT

(1998) Analysis of mannose selection for the production of transgenic

sugar beet. Mol Breed 4: 111–117.

19.Kahn RS, Sjahril R, Nakamura I, MiiM (2008) Production of transgenic

potato exhibiting enhanced resistance to fungal infections and herbicide

applications. Plant Biotechnol 2:13–20

20.Kevil CG, Walsh L, Laroux FS, Kalogeris T, Grisham MB, Alexander JS

(1997) An Improved, Rapid Northern Protocol. Biochem and Biophys.

Research Comm. 238:277-279.

21.Kosugi S, Ohashi Y, Nakajima K, Arai Y (1990) An improved assay for

β-glucuronidase in transformed cells: methanol almost completely

suppresses a putative endogenous β-glucuronidase activity. Plant Sci 70:

133–140.

22.Kunze I, Ebneth M, Heim U, Geiger M, Sonnewald U, Herbers K (2001)

2-Deoxyglucose resistance: a novel selection marker for plant

transformation. Mol Breed 7: 221–227.20

23.Lee MLT, Kuo FC, Whitmore GA, Sklar J (2000) Importance of

replication in microarray gene expression studies: statistical methods and

evidence from repetitive cDNA hybridizations. Proc Natl Acad Sci USA

97: 9834–9839

24.Levine MJ (2007) Pesticides: a toxic time bomb in our midst. Praeger,

USA: 213–214

25.Lê Trần Bình (2008) Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt nam. NXB

Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.

26.Long S and Rebagliati M (2002) Sensitive two-color whole-mount in situ

hybridizations using digoxygenin - and dinitrophenol-labeled RNA

probes. BioTechniques 32: 494–500.

27.Lopez SJ, Kumar RR, Pius PK, Muraleedharan N (2004) Agrobacterium

tumefaciens-mediated genetic transformation in Tea (Camellia sinensis

[L.] O. Kuntze). Plant molecular biology reporter 22: 201a-201j.

28.Lucca P, Ye X, Potrykus I (2001) Effective selection and regeneration of

transgenic rice plants with mannose as selective agent. Mol Breed 7: 43–

49.

29.Matthews PR, Wang MB, Waterhouse PM, Thornton S, Fieg SJ, Gubler

F, Jacobsen JV (2001). Marker gene elimination from transgenic barley,

using co-transformation with adjacent „twin T-DNAs‟ on standard

Agrobacterium transformation vector. Mol Breed 7: 195- 202.

30. Muhitch MJ (1998) Characterization of pedicel β-glucuronidase activity

in developing maize (Zea mays) kernels. Physiol Plant 104: 423–430.

31.Negrotto D, Jolley M, Beer S, Wenck AR, Hansen G (2000) The use of

phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic

maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation. Plant Cell

Rep 19: 798–803.

32.Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng hà, Lê Trần

Bình (2008) Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dưa chuột bằng kỹ

thuật RNAi. Tạp chí Công nghệ sinh học số 6: 679 – 687.

33.Phạm Thị Vân (2009) Nghiên cứu tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm bằng

kỹ thuật RNAi. Luận văn Thạc sỹ sinh học.

34.Schlamp K, Weinmann A, Krupp M, Maass T, Galle PR, Teufel A (2008)

BlotBase: A northern blot database. Gene 427: 47-5021

35.Serres R, McCown B, Zeldin E (1997) Detectable glucuronidase activity

in transgenic cranberry is affected by endogenous inhibitors and plant

development. Plant Cell Rep 16: 641–646.

36. Thomasset B, Ménard M, Boetti H, Denmat LA, Inzé D, Thomas D

(1996) β-Glucuronidase activity in transgenic and non-transgenic tobacco

cells: specific elimination of plant inhibitors and minimization of

endogenous GUS background. Plant Sci 113: 209–219

37.Tör M, Mantell SH, Ainsworth C (1992) Endophytic bacteria expressing

β-glucuronidase cause false positives in transformation of Dioscorea

species. Plant Cell Rep 11: 452–456.

38.Tuong Van Nguyen (2008) Genetic engineering of grain sorghum

(Sorghum bicolour (L.) Moench) for nutritional quality improvement.

Thesis submitted in requirement for Doctoral in Applied Biological

Siences.

39.Wang AS, Evans RA, Altendorf PR, Hanten JA, Doyle MC, Rosichan JL

(2000) A mannose selection system for production of fertile transgenic

maize plants from protoplast. Plant Cell Rep. 19: 654–660.

40.Wright M, Dawson J, Dunder E (2001) Efficient biolistic transformation

of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum aestivum L.) using the

hosphomannose isomerase gene, pmi, as the selectable marker. Plant Cell

Rep 20: 429–436

[FONT=Times New Roman]Luận văn dài 21 trang,chia làm 3 chương