[FONT=Times New Roman]MỞ ĐẦU

Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây mô

hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng. Vì vậy,

thuốc lá là một trong những đối tƣợng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các

nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là làm đối tƣợng chuyển gen.

Khảm lá bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, bệnh khảm lá gây thiệt hại

nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng thuốc lá, nhất lá đối với thuốc lá

sợi vàng. Bệnh khảm thuốc lá do hai loại virus TMV (Tobacco mosaic virus)

và CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra. Trong đó, TMV loại virus có phổ

ký chủ rất rộng có tới 230 loài thuộc 32 họ và là một trong virus gây hại trên

thực vật đƣợc mô tả sớm nhất ở nƣớc ta.

Những phƣơng pháp thông dụng để khắc phục bệnh khảm lá nhƣ sử dụng

giống kháng bệnh, giống sạch bệnh và các biện pháp canh tác( trồng luận

canh cây thuốc lá với cây lúa, vệ sinh đồng ruộng...). Tuy nhiên, những biện

pháp này không những chỉ có tác dụng làm giảm bớt sự lây lan và phát triển

của bệnh, chủ yếu chỉ manh tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh

này mà còn đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hƣởng xấu tới môi

trƣờng.

Hiện nay, nhờ những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền mà ngƣời ta đã tạo

ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách

đƣa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gene) của virus vào genome của thực

vật.

Xuất phát từ cơ sở thực tiễn trên, giống thuốc lá C9-1 đã đƣợc lựa chọn cho

nghiên cứu “ Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm

tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá” với các nội dung và mục

đích nghiên cứu: (1) Chuẩn hóa phƣơng pháp chuyển gen vào giống thuốc lá

C9-1 thông qua cấu trúc mang chỉ thị gus; (2) Tạo cây thuốc lá chuyển gen

mang cấu trúc TMV-RNAi; (3) Bƣớc đầu phân tích cây chuyển gen bằng

phƣơng pháp PCR

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .............................................................................. 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................. 2

MỞ ĐẦU....................................................................... 3

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................. 4

1.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ ............. 4

1.1.1.Phân loại.............................................................. 4

1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá................................. 5

1.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam...... 6

1.2. MỘT SỐ BỆNH THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ ...................... 8

1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá ........................................................ 8

1.2.2. Bệnh khảm lá do virus ..................................................... 10

1.3. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC ................................................. 14

1.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh: ............................................ 14

1.3.2.Sử dụng giống sạch bệnh................................................ 15

1.3.3. Các biện pháp canh tác.................................................. 15

1.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học................................. 15

1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus......... 18

1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi ................................................. 18

1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT

NAM. ................................................................. 19

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP............................... 21

2.1. VẬT LIỆU............................................................................... 21

2.1.1.Vật liệu thực vật....................................................... 21

2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen:................................ 21

2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng............................................. 22

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 22

2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: ................................................... 22

2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo ................................................. 22

2.2.1.2. Gieo hạt.................................................................. 22

2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium

tumafaciens .............................................................................. 23

2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium....................... 2351

2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen ............................................... 23

2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy ............................................. 23

2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen...................................... 24

2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh.................................................. 24

2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phƣơng pháp nhuộm mô hóa tế bào............. 24

2.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phƣơng

pháp PCR ............................................................................................. 25

2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số ..................................................... 25

2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR....................................................... 25

2.2.5. Phân tích khả năng kháng virus của các cây chuyển gen bằng phƣơng

pháp lây nhiễm nhân tạo ............................................................. 26

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................... 28

3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC

LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS .......... 28

3.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen ............... 29

3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây ............................ 29

3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi .. 29

3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh .......................... 32

3.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào...... 35

3.2. CÁC KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN

MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi..................................... 35

3.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi ......... 35

3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus ............. 37

3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân

tạo ...................................................... 37

3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây .................. 38

3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số ...................................... 38

3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR ................................ 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO....................... 42