Trang nhan đề

Lời cảm ơn

Mục lục

Các từ viết tắt

Danh mục

Lời mở đầu

Chương_1: Tổng quan tài liệu

Chương_ 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương_ 3: Kết quả và biện luận

Kết luận và đề nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

MỤC LỤC

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY XUYÊN TÂM LIÊN . . 3

1.1.1 Mô tả thực vật 3

1.1.2 Phân bố 4

1.1.3 Sinh thái, trồng trọt và thu hoạch . 4

1.1.4 Thành phần hóa học . 5

1.1.5 Tác dụng dược lý .7

1.1.6 Một số nghiên cứu về chiết xuất và định lượng diterpen lacton trong Xuyên tâm

liên trong nước và trên thế giới .9

1.2 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO . 11

1.2.1 Định nghĩa 11

1.2.2 Ứng dụng của HPLC trong định tính dược liệu .11

1.2.3 Chất đối chiếu 12

1.2.4 Thẩm định quy trình phân tích . 13

1.3 GIỚI THIỆU HERPES SIMPLEX VIRUS 16

1.3.1 Phân loại 16

1.3.2 Đặc điểm-hình thái-cấu tạo . .16

1.3.3 Sự sinh sôi của HSV-2 . 18

1.3.4 Quá trình phiên mã và biểu hiện gen .20

1.3.5 Sự biểu hiện bệnh 21

1.3.6 Chẩn đoán Herpes simplex virus .21

1.3.7 Phòng bệnh và điều trị .23

1.3.8 Phương pháp nghiên cứu tác nhân có tác dụng kháng HSV .24

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 28

2.1.1 Dược liệu 28

2.1.2 Vật liệu Sinh học 28

2.2 HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY . 28

2.2.1 Hóa chất chiết xuất và kiểm tra dược liệu .28

2.2.2 Hóa chất thử hoạt tính kháng virus . .29

2.3 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ .30

2.3.1 Dụng cụ thiết bị trong chiết xuất dược liệu .30

2.3.2 Thiết bị phân tích .31

2.3.3 Dụng cụ thiết bị thực hiện phản ứng Sinh học .31

2.4 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC DITERPEN

LACTON TỪ XUYÊN TÂM LIÊN . .32

2.4.1 Chiết xuất diterpen toàn phần từ Xuyên tâm liên 32

2.4.2 Phân lập 3 diterpen lacton chính từ cao chiết Xuyên tâm liên 33

2.4.3 Xác định lý hóa tính, các phổ nghiệm của 3 diterpen lacton phân lập được

34

2.5 Xây dựng QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 3 DITERPEN LACTON

BẰNG HPLC .34

2.5.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống . .35

2.5.2 Thẩm định quy trình định lượng 35

2.5.3 Xử lý thống kê .3 6

2.5.4 Áp dụng quy trình đã Xây dựng để định lượng diterpen lacton trong dược liệu

ban đầu và mẫu cao loại màu của Xuyên tâm liên .36

2.6 QUY TRÌNH THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VIRUS HERPES SIMPLEX

(HSV) CỦA CAO CHIẾT XUYÊN TÂM LIÊN VÀ 3 DITERPEN LACTON 37

2.6.1 Nuôi cấy tế bào 37

2.6.2 Phương pháp đếm tế bào 38

2.6.3 Tạo nguồn HSV chuẩn . 39

2.6.4 Xác định TCID50 của hỗn dịch virus .39

2.6.5 Chuẩn bị dịch thử . 41

2.6.6 Phương pháp nhuộm tế bào bằng xanh methylen 41

2.6.7 Phương pháp thử nghiệm độc tính tế bào (Cytotoxicity assay) .42

2.6.8 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng virus (Antivirus assay) .43

2.6.9 Tính chỉ số chọn lọc SI (hệ số trị liệu SI) 44

3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37

3.1 CHIẾT XUẤT DITERPEN LACTON TOÀN PHẦN TỬ LÁ XUYÊN

TÂM LIÊN 45

3.2 PHÂN LẬP 3 DITERPEN LACTON CHÍNH TỪ CAO CHIẾT XTL

46

3.2.1 Phân lập A1 46

3.2.2 Phân lập A2 và A3 48

3.3 XÁC ĐỊNH LÝ HÓA TÍNH VÀ CÁC PHỔ NGHIỆM CỦA 3

DITERPEN LACTON PHÂN LẬP ĐƯỢC .49

3.3.1 Cảm quan .49

3.3.2 Phản ứng hóa học . 50

3.3.3 Điểm nóng chảy .50

3.3.4 Sắc ký lớp mỏng 51

3.3.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao .52

3.3.6 Phổ tử ngoại .55

3.3.7 Phổ hồng ngoại .56

3.3.8 Phổ khối (MS) 57

3.3.9 Phổ proton NMR (1H-NMR) .57

3.3.10 Phổ carbon 13 NMR (13C-NMR) .58

3.4 Xây dựng QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG .6 0

3.4.1 Thăm dò điều kiện tách 3 diterpen lacton trên HPLC .60

3.4.2 Xây dựng quy trình định lượng .61

3.4.3 Khảo sát tính tương thích hệ thống . .63

3.4.4 Thẩm định quy trình định lượng 66

3.4.5 Quy trình định lượng andrographolid, dehydroandrographolid và

neoandrographolid trong dược liệu Xuyên tâm liên bằng HPLC .72

3.4.6 Áp dụng quy trình đã Xây dựng để định lượng 3 diterpen lacton chính trong bột

lá Xuyên tâm liên và cao chiết loại màu .73

3.5 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG HSV-1 VÀ HSV-2 CỦA CAO

VÀ CÁC CHẤT TINH KHIẾT . 74

3.5.1 Xác định hiệu giá virus theo TCID50 .74

3.5.2 Khảo sát độ độc của cao chiết và chất tinh khiết trên tế bào Vero 75

3.5.3 Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 của cao chiết và chất tinh khiết trên tế bào

Vero 80

3.5.4 So sánh khả năng ức chế virus của cao chiết và các chất tinh khiết 89

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 9