MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Cúm gà (avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loài chim, kể cả gia cầm và thuỷ cầm, do các subtype khác nhau thuộc nhóm virus cúm A gây nên. Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên một số loài chim mang virus gây bệnh, nhưng không có biểu hiện của bệnh. Đây là mối nguy hiểm lan truyền bệnh cho các loài gia cầm khác. Ngoài ra, chúng còn là nơi cung cấp nguồn tàng trữ biến đổi nguồn gen tạo nên các subtype mới. Các subtype virus cúm A gây bệnh trên người đều có nguồn gốc tiến hoá biến thể và biến chủng từ động vật và sau khi thích ứng trên người thì gây bệnh, trước đây đã tạo nên những vụ dịch thảm khốc, rồi biến mất sau một thời gian lại tái hiện và gây nên đại dịch mới. Năm 2004 các đại dịch cúm gia cầm tại các nước châu Á (bao gồm dịch do H5N1 gây ra tại Trung Quốc, Nhật, Nam Triều Tiên, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Campuchia và Lào; do H7N3 (Pakistan); do H5N2 ( Đài Loan) đã gây thiệt hại hàng trăm triệu gia cầm, làm chết hàng chục người ở Việt Nam và tại Thái Lan. Chủng H5N1 điển hình ở châu Á có tính kháng nguyên và di truyền giống với chủng A/Vietnam/1203/04.

Để phòng chống sự lây lan mạnh mẽ của đại dịch cúm gia cầm, hàng năm Việt Nam cần một lượng vaccine rất lớn để tiêm chủng cho hàng trăm triệu con gà vịt. Ngoài những công nghệ sẵn có Việt Nam đang tìm kiếm những công nghệ sản xuất vaccine có ý nghĩa kinh tế, an toàn và hiệu quả cao. Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật sẽ là nguồn vaccine đáp ứng được các tiêu điểm đó và sẽ đem lại nhiều lợi ích cho ngành thú y và được xem là hướng đi phù hợp với những nước đang phát triển vì mục đích chăm sóc sức khoẻ cộng đồng như Việt Nam.

Chuyển gen mã hóa các vaccine tái tổ hợp vào thực vật cụ thể là vào các cây trồng là nguồn thức ăn chính cho con người, động vật nuôi là một trong những hướng đi chính hiện nay. Tuy nhiên bên cạnh đó, một xu hướng cũng được bắt đầu quan tâm nghiên cứu và ứng dụng là sử dụng hệ thống nuôi cấy sinh khối tế bào để sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Do tế bào thực vật có ưu thế nuôi cấy dễ dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng hơn cả tế bào thực vật nuôi cấy in vitro không mang các mầm bệnh cho người.

Với mục đích tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sỹ là: “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá”.

2. Mục tiêu của đề tài

- Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1.

- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây thuốc lá tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A.rhizogens.

3. Nội dung nghiên cứu

- Ghép nối gen HA1 mã hóa tiểu phần protein vỏ virus H5N1 vào vector mang pENTR 221/cal để tạo vector tái tổ hợp.

- Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1.

- Tạo vector chuyển gen vào thực vật mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1 và biến nạp vào vi khuẩn A. rhizogens.

- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây thuốc lá tạo rễ tơ thông qua A.rhizogens.

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1. Cúm A/H5N1 3

1.1.1. Cấu tạo 3

1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ 5

1.1.3. Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 7

1.1.4. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 8

1.2. Kháng nguyên HA 10

1.3. Tình hình nghiên cứu cúm A và vấn đề nghiên cứu vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới 12

1.3.1. Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới.. 12

1.3.2. Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới 16

1.4. Kỹ thuật chuyển gen thông qua A.rhizogens và ứng dụng 19

1.4.1. Giới thiệu vi khuẩn A.rhizogens 19

1.4.2. Hệ vector nhị thể 21

1.4.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp 23

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 25

2.1.1. Vật liệu 25

2.1.2. Hóa chất 25

2.1.3. Thiết bị 26

2.2. Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1. Phương pháp nhân đoạn gen HA1bằng kỹ thuật PCR 26

2.2.2. Phương pháp ghép nối đoạn gen HA1vào pENTR221/cal 28

2.2.3. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E. coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt 30

2.2.4. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway 32

2.2.5. Biến nạp vector chuyển gen vào A. rhizogenes ATCC15834 35

2.2.6. Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa protein vỏ virus vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 36

2.2.7. Phương pháp đánh giá cây trồng chuyển gen 37

2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1. Kết quả tách dòng gen HA1 40

3.1.1. Kết quả PCR nhân đoạn gen HA1 40

3.1.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 41

3.1.3. Ghép nối đoạn gen HA1 vào vector pENTR/cal 42

3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 bằng kỹ thuật Gateway®. 47

3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp theo phản ứng LR 47

3.2.2. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR 48

3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 48

3.3. Kết quả biến nạp pK7WG2D/cal/HA1 vào vi khuẩn A.rhizogenes 49

3.4. Kiểm tra hệ thống tạo rễ tơ chuyển gen thông qua A.rhizogenes sử dụng gen chỉ thị Gus 51

3.5. Kết quả chuyển gen HA1 vào mảnh lá thông qua A. rhizogens để tạo các dòng rễ tơ chuyển gen HA1 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 66