MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....

1.1. Tổng quan về cây bạch đàn .

1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam..

1.3. Tình hình sinh trưởng của cây bạch đàn ở Việt Nam .

1.4. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật .

1.4.1. Lignin ..

1.4.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật ...

1.4.3. Giới thiệu về gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase

(CAD)

1.5. Tổng quan về promoter .

1.5.1. Mô hình điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn. .....

1.5.2. Cấu trúc và chức năng của promoter ....

1.5.3. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học ...

1.5.4. Promoter điểu khiển hoạt động gen ở tầng xylem Error! Bookmark not defined.

1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...

2.1. Vật liệu nghiên cứu .

2.1.1. Vật liệu: .....

2.1.2. Hoá chất:....

2.1.3. Máy móc, thiết bị ...

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu

2.2. Phương pháp nghiên cứu.....

2.2.1. Phương pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme

CAD trên ngân hàng gen quốc tế .....

2.2.2. Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng gen/promoter.

2.2.3. Tách chiết và tinh sạch DNA – RNA từ mô gỗ

2.3.4. Tổng hợp cDNA

2.2.5. Khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn gen CCR bằng phản ứng

PCR .....

2.2.6. Phương pháp tách dòng .....

2.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Error! Bookmark not defined.

2.2.8. Phương pháp xác định trình tự của gen. .....

2.2.9. Phương pháp Gateway.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....

3.1. Tách chiết DNA bạch đàn...

3.2. Khuếch đại promoter bằng PCR .....

3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD

3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp

3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5. ....

3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp. .

3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp .

3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD2....

3.3.6. Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của promoter gen CAD tách dòng được từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake.....

3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI ..... KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

1.1. Lý do chọn đề tài

Lignin là một trong hai loại polymer sinh học phổ biến trong cây, sau cellulose. Nó chiếm khoảng 30% lượng cacbon hữu cơ trong sinh quyển và gần 35% lượng vật chất khô trong gỗ của các loài thực vật. Quá trình tổng hợp lignin là một trong những cách thức thích nghi của thực vật trong quá trình tiến hóa khi thực vật thay đổi môi trường sống từ nước lên cạn. Lignin giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc thành tế bào và thân. Thêm vào đó lignin tham gia vào quá trình vận chuyển nước, các chất dinh dưỡng thông qua hệ thống bao mạch và giữ vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự chắc chắn của cây trong không gian, cũng như bảo vệ cây khỏi các nhân tố gây bệnh . Hàm lượng lignin cao trong gỗ giúp gỗ bền. Bởi vậy, nó là nguyên liệu thô tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng, nội thất,...) và là một loại nhiên liệu hoàn hảo.

Tuy nhiên trong một số lĩnh vực như sản xuất sợi, sản xuất giấy thì hàm lượng lignin cao lại là một trở ngại. Việc loại bỏ lignin trong quy trình sản xuất bột gỗ bằng cách xử lý hóa học là một trong những biện pháp tốn kém đối với điều kiện kinh tế và môi trường nước ta hiện nay . Vậy làm thế nào để điều chỉnh được hàm lượng lignin trong cây theo hướng có lợi cho bản thân sinh vật và con người, như: tăng hàm lượng lignin trong cây trồng làm nhiên liệu, trong xây dựng, trong cây nông nghiệp (cây lúa – chống đổ) hay giảm hàm lượng lignin trong cây bạch đàn nhằm tạo thuận lợi cho quá trình sản xuất giấy.

Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu (chủ yếu là ở nước ngoài) về lignin, quá trình sinh tổng hợp lignin, các enzyme tham gia vào quá trình này như enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) và enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD), nhưng đa phần là trên các cây mô hình (Arabidopsis thaliana, Populus trichocarpa) ,,.

Nhằm mục đích điều khiển sự biểu hiện của một số enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lignin ở mô phân sinh gỗ cho một số đối tượng cây lâm nghiệp bằng phương pháp chuyển gen, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake)” làm vật liệu để thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen ở thực vật.

1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.2.1. Mục tiêu

Tách dòng, phân tích trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake).

1.2.2. Nội dung nghiên cứu

- Tập hợp thông tin về trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và trình tự nucleotide đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA dehydrogenase (CCR) đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để thiết kế cặp mồi khuếch đại đoạn gen này từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake).

- Tách dòng, phân tích trình tự đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme CAD và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme CCR từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake)