TÓM TẮT

“THIẾT LẬP QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT”.

Đề tài là một hướng nghiên cứu phát triển của phương pháp lai phân tử trong điều kiện phòng thí nghiệm, mà bước đầu là hoàn thiện phương pháp Southern blot áp dụng trên vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được thực hiện theo qui trình của Kurt Weising và ctv (1995) và qui trình của kit Gene Image AlkPhos Direct Labelling and Detection System Amersham. Qui trình trải qua các giai đoạn từ bước chuẩn bị mẫu lai như tăng sinh vi khuẩn; ly trích genomic DNA; thực hiện phản ứng cắt; điện di chuyển lên màng và làm khô màng đến tạo được phân tử đánh dấu từ sản phẩm PCR của gen phlD sau khi đã được tinh sạch bằng phương pháp cắt gel, cuối cùng thực hiện phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X-ray. Với kết quả đạt được là:

- Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn

- Đánh dấu probe từ sản phẩm PCR trên cặp primer B2BF, BRR4

- Thiết lập được phản ứng lai và cho phát hiện kết quả lai trên phim X – ray. Tuy nhiên, đề tài vẫn chưa được hoàn thiện trên các mẫu là genomic DNA đã được cắt bằng enzyme giới hạn.

Tóm lại, chúng tôi đã thiết lập được qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas fluorescens nhưng vẫn chưa hoàn thiện được qui trình ở mức genomic DNA. Kết quả này là cơ sở ban đầu trong việc hoàn thiện phương pháp lai phân tử để phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật.

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa

Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt vi

Danh mục các hình vii

Danh mục các bảng ix

Phần 1. MỞ ĐẦU 1

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU – PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT 3

2.1 Lịch sử phát triển của phương pháp Southern blot 3

2.2 Nguyên tắc của phương pháp Southern blot 4

2.3 Một số ứng dụng của phương pháp Southern blot 4

2.4 Sự khác nhau giữa Southern blot, Northern blot, và Western blot 5

2.5 Một số phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn 5

2.5.1 Phương pháp sử dụng SDS 6

2.5.2 Phương pháp sử dụng CTAB 7

2.5.3 Phương pháp sử dụng Phase Lock Gel TM (Jones và Bartlet, 1990) 8

2.6 Một số phương pháp định tính và định lượng DNA 9

2.6.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế 9

2.6.2 Điện di (Electrophoresis) 10

2.6.3 Định lượng DNA bằng phân tử Mass 11

2.7 Enzyme giới hạn (Restriction enzyme) 12

2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn 12

2.7.2 Các loại enzym giới hạn 13

2.7.3 Các kiểu cắt của enzym giới hạn 13

2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng 15

2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 15

2.8.1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA Polymerase 16

2.8.2 Ứng dụng phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn Pseudomonas fluorescense

định cư trong đất và trong vùng rễ cây trồng 16

2.9 Phương pháp tinh sạch DNA 17

2.9.1 Phương pháp tinh sạch DNA bằng phenol 17

2.9.2 Phương pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX 17

2.10 Các phương pháp chuyển DNA lên màng 19

2.10.1 Phương pháp mao dẫn hướng lên (Upward Capillary Transfer) 19

2.10.2 Phương pháp mao dẫn hướng xuống (Downward Capillary Transfer) 21

2.10.3 Phương pháp mao dẫn hai chiều

(Simultaneous Transfer to Two Membranes) 21

2.10.4 Phương pháp chuyển bằng điện (electrophoresis transfer) 22

2.10.5 Phương pháp chuyển bằng chân không 23

2.11 Đánh dấu probe 24

2.11.1 Tác nhân đánh dấu 24

2.11.1.1 Hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ 24

2.11.1.2 Hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ 25

2.11.2 Phương pháp đánh dấu 29

2.11.2.1 Phương pháp nick – translation 29

2.11.2.2 Phương pháp random priming (thiết lập mồi ngẫu nhiên) 30

2.11.2.3 Phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi) 32

2.11.2.4 Phương pháp photobiotin 32

2.12 Các phương pháp lai phân tử 35

2.12.1 Cơ sở của sự lai phân tử 35

2.12.1.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA 35

2.12.1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA 36

2.12.1.3 Khái niệm về lai phân tử 37

2.12.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử 37

2.12.2 Các kiểu lai phân tử 37

2.12.2.1 Lai trong pha lỏng 37

2.12.2.2 Lai trên pha rắn 38

2.12.2.3 Lai tại chổ (in situ hybridization) 39

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

3.1 Thời gian và địa điểm 40

3.2 Nội dung nghiên cứu 40

3.3 Phương pháp nghiên cứu 40

3.3.1 Vật liệu thí nghiệm 40

3.3.2 Phương pháp tiến hành 43

3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB 42

3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 42

3.3.2.3 Hiệu chỉnh nồng độ và định lượng DNA bằng phân tử Mass 45

3.3.2.4 Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng ezyme giới hạn 46

3.3.2.5 Thực hiện phản ứng PCR trên hai cặp primer B2BF, BRR4 48

3.3.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel 50

3.3.2.7 Thực hiện đánh dấu sản phẩm PCR của cặp primer B2BF, BRR4. 51

3.3.2.8 Tạo mẫu lai 52

3.3.2.9 Lai Southern 55

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57

4.1 Kết quả tăng sinh, ly trích và định lượng DNA 57

4.1.1 Kết quả ly trích genomic DNA 57

4.1.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ 58

4.1.3 Kết quả định lượng bằng phân tử Mass 59

4.2 Kết quả phản ứng cắt DNA bằng enzyme giới hạn 59

4.3 Kết quả phản ứng PCR với hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b 61

4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel 62

4.5 Kết quả lai Southern 63

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69

5.1 Kết luận 69

5.2 Đề nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

Phụ lục 1 77

Phụ lục 2 79

Phụ lục 3 82

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

bp: base pair

B: Bam HI

CTAB: Cethyltrimethylammonium bromide

DNA: Deoxyribonucleic acid

2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol

DIG: Digoxigenin

dNTP: 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate

dGTP: deoxyguanosine triphosphate

dCTP: deoxycytidine triphosphate

dATP: deoxyadenosine triphosphate

dTTP: deoxythymidine triphosphate

E: Eco RV

ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid

H: Hind III

HRP: Horseradish peroxydase

Kb: kilobase

PCR: Polymerase Chain Reaction

RE: Restriction Enzyme

RFLP: Restriction fragment length polymorphism

RNA: Ribonucleic acid

SDS: Sodium dodecyl sulfate

SSC: Saline sodium citrate

TAE: Tris Acetate EDTA

Taq: Thermus aquaticus

UV: Ultraviolet (light)

w/v: Weight for volume

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1Thang chuẩn về nồng đô của phân tử Mass 10

Hình 2.2 Sự mao dẫn hướng lên 20

Hình 2.3 Sự mao dẫn hướng xuống 21

Hính 2.4 Sự mao dẫn hai chiều 22

Hình 2.5 Phương pháp chuyển bằng điện 23

Hình 2.6 Phương pháp chuyển bằng chân không 23

Hình 2.7 Phản ứng khởi động của chemiluminescence 26

Hình 2.8 Cấu trúc của digoxigenin- 11- dUTP. 28

Hình 2.9 Cấu trúc của biotin và hai thể đồng phân của biotin nucleotide, biotin- 7- dATP và biotin- 14- dATP 28

Hình 2.10 Đánh dấu probe bằng phương pháp nick translation 29

Hình 2.11 Đánh dấu DNA bằng phương pháp random priming 30

Hình 2.12 Đánh dấu “end labelling” dùng enzym polynucleotide kinase (PNK) 32

Hình 2.13 Cấu trúc của photobiotin acetate 34

Hình 2.14 Sự tạo liên kết giữa nucleic acid và tác nhân đánh dấu (biotin) tại vị trí N-7 của purine . 33

Hình 2.15 Cơ chất chemiluminogenic đối với alkaline phosphatase 35

Hình 3.1 Qui trình cho một thử nghiệm Southern blot 43

Hình 3.2 Tổ hợp 6 gen sinh tổng hợp chất 2,4 – DAPG 49

Hình 3.3 Hệ thống mao dẫn chuyển DNA lên màng Hybond N chưa hoàn chỉnh 53

Hình 3.4 Hệ thống chuyển DNA lên màng Hybond N hoàn chỉnh 53

Hình 3.5 Đánh dấu bề mặt chứa DNA của màng Hybond N 54

Hình 3.6 Làm khô màng Hybond N bằng tủ sấy ở 65 oC 54

Hình 3.7 Để màng Hybond N vào máy GS Gene Linker TM UV

chuẩn bị xử lý UV 54

Hình 3.8 Phản ứng lai trong buồng lai HB – 1000 Hybridizer ở 55 oC 55

Hình 4. 1 Kết quả ly trích DNA từ các dòng Pseudomonas fluorescens sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường LB ở nhiệt độ 27oC 57

Hình 4.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA ly trích từ các dòng Pseudomonas fluorescens khác nhau 58

Hình 4.3 Kết quả định lượng mẫu 130 bằng phân tử Mass 59

Hình 4.4 Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzym giới hạn 60

Hình 4.5 Sản phẩm PCR với 2 cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b 61

Hình 4.6 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR các mẫu 4, 28, 9, 13120, 154 bằng phương pháp cắt gel 62

Hình 4.7 Kết quả thí nghiệm 1, lai ở 55oC, thời gian lai 12 giờ, thời gian ủ 30 phút. 64

Hình 4.8 Kết quả thí nghiệm 1, lai ở 55oC, thời gian lai 12 giờ, ủ 30 phút 64

Hình 4.9 Kết quả thí nghiệm 2 66

Hình 4.10 Kết quả lai ở nhiệt độ 48oC 67

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Những điểm khác nhau cơ bản giữa Southern blot, Northern blot và Western blot. 5

Bảng 2.2 Các thông số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass 10

Bảng 2.3 Một số enzyme thường sử dụng và các trình tự đặc hiệu 15

Bảng 2.4 Thành phần của một phản ứng PCR 16

Bảng 2.5 Phương pháp đánh dấu không phóng xạ và hệ thống phát hiện dùng cho oligonucleotide 31

Bảng 3.1: Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 25 µl 47

Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl 47

“THIẾT LẬP QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT”.