PHẦN MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong chăn nuôi heo, vấn đề quan trọng là heo phải mắn đẻ, sai con, tốc độ tăng

trưởng nhanh, ít tiêu tốn thức ăn và phẩm chất quày thịt tốt. Vì vậy các nhà chọn giống

đã không ngừng nghiên cứu, chọn lọc và cải tạo giống nhằm đem lại năng suất và hiệu

quả cao nhất. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và hiệu quả kinh tế của

việc chăn nuôi heo như: phẩm chất con giống, dinh dưỡng, trình độ chăm sóc quản lý,

vệ sinh phòng bệnh Trong đó phẩm chất con giống là yếu tố đặc biệt quan trọng.

Để cải thiện năng suất sinh sản trên heo nái, đặc biệt là số con trên ổ, tỉ lệ sống sót

của các heo con sau khi sinh các nhà chọn giống ở các nước đã áp dụng nhiều chương

trình chọn giống mới kết hợp với phương pháp chọn lọc truyền thống. Người ta đã tiến

hành chọn giống heo dựa vào gen đánh dấu (Marker assisted selection – MAS). Theo

các nghiên cứu của Vincent và cộng sự (1998), Drogemuller và cộng sự (2000),

Rothchild và cộng sự (1996, 2000) cho thấy gen thụ thể prolactin (PRLR), gen thụ thể

estrogen (ESR) và retinol binding protein 4 (RBP4) có mối liên hệ với năng suất sinh

sản của nái. Trong nước đã có một số tác giả đã áp dụng kỹ thuật PCR trong việc phát

hiện sự hiện diện của các gen có liên quan đến sự sinh sản của heo (Lê Thị Thúy và

cộng sự, 2002; Nguyễn Ngọc Tuân và cộng sự, 2001; Võ Thị Tuyết và cộng sự, 2005)

Công nghệ sinh học đã bắt đầu đi vào giải quyết các vấn đề thực tiễn của nghành

chăn nuôi. Được sự đồng ý của Ban chủ nhiệm Bộ môn công nghệ sinh học, dưới sự

hướng dẫn của TS. Võ Thị Tuyết chúng tôi tiến hành đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật

PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire”

46

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU .1

1.1 Đặt vấn đề . .1

1.2 Mục đích - yêu cầu . 1

1.2.1 Mục đích 1

1.2.2 Yêu cầu . .1

PHẦN 2: TỔNG QUAN .3

2.1 Giới thiệu sơ lược về giống heo Yorshire 3

2.1.1 Prolactin 3

2.1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo .3

2.1.1.2 Tác dụng của prolactin .3

2.1.1.3 Cơ chế tác động của prolactin 4

2.1.1.4 Gen thụ thể prolactin 5

2.2 Giới thiệu về DNA (Deoxiribonucleotide acid) 6

2.2.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA 8

2.2.2 Gen, allen và sự đa hình của gen . 10

2.2.2.1 Gen .10

2.2.2.1.1 Sự biểu hiện của gen hay sự điều hoà hoạt động của gen .10

2.2.2.1.2 Sự liên kết giữa gen và marker 11

2.2.2.2 Allen và sự đa hình của gen .11

2.2.3 Phương pháp chiết tách DNA từ mô động vật 12

2.2.4 Phương pháp định tính và định lượng cho DNA 13

2.2.4.1 Định lượng bằng phương pháp đo OD (optical density) 13

2.2.4.2 Định tính DNA bằng phương pháp điện di 13

2.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .14

2.3.1 Giới thiệu về phản ứng PCR .14

2.3.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR .14

2.3.2.1 Taq polymerase 14

2.3.2.2 Các nucleotid .15

2.3.2.3 Primer (mồi) .15

2.3.2.4 Dung dịch đệm .15

47

2.3.2.5 DNA khuôn .16

2.3.2.6 Số chu kỳ phản ứng 16

2.3.2.7 Nhiệt độ và pH .16

2.3.2.6 Các vấn đề thường gặp trong PCR và phương pháp khắc phục .16

2.3.2.7 Ứng dụng của PCR .18

2.4 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR – RFLP .18

2.4.1 Kỹ thuật RFLP ( restricton fragment length polymorphism) 18

2.4.2 Kỹ thuật PCR – RFLP .19

2.5 Các enzyme giới hạn .20

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHưƠNG PHÁP KHẢO SÁT 21

3.1 Thời gian, địa điểm . 21

3.1.1 Thời gian 21

3.1.2 Địa điểm .21

3.2 Đối tượng khảo sát .21

3.3 Nội dung thực hiện .21

3.4 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu . 21

3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm .21

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu . 22

3.4.2.1 Thu thập mẫu . .22

3.4.2.2 Ly trích DNA . .23

3.4.2.3 Định lượng DNA bằng quang phổ kế .24

3.4.2.4 Ứng dụng phương pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen PRLR 24

3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn 24

3.4.2.5 Ứng dụng PCR phát hiện ra gen thụ thể prolactin và xác định tần số các

kiểu gen PRLR trên các mẫu phân tích 27

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Hiệu quả ly trích DNA từ mẫu máu và mẫu da tai 30

4.1.1 Mẫu máu 30

4.1.1 Mẫu da tai . .31

4.2 Kết quả việc thực hiện phản ứng PCR . 33

4.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo các qui trình khác nhau .33

4.2.1.1 Qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp khác nhau .33

48

4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau 35

4.3 Kết quả thực hiện cắt enzyme giới hạn trên các qui trình khác nhau 38

4.4 Tần số xuất hiện của các kiểu gen trong quần thể .40

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .43

5.1 Kết luận .43

5.2 Kiến nghị .43

Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshir