MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1. TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI 2

1.1.1. Khái niệm về huyết thanh người 2

1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người 2

1.1.3. Chức năng của các protein trong huyết thanh 3

1.1.4. Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam 4

1.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh 4

1.1.6. Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh 6

1.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE) 7

1.2.1. Giới thiệu chung 7

1.2.2. Tiến trình hoạt động của 2-DE 7

1.2.3. Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE 9

1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của điện di 2-DE 9

1.2.5. Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS) 10

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2. Hóa chất 15

2.1.3. Thiết bị 16

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.1. Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh 16

2.2.2. Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau 16

2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford 17

2.2.4. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) 18

2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) 19

2.2.6. Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin 20

2.2.7. Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS 20

2.2.8. Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8 21

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1. Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt 23

3.2. Điện di SDS–PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được 24

3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford 25

3.4. Điện di 2-DE protein bền nhiệt 27

3.5. Điện di 2-DE protein bền nhiệt trên dải pH hẹp 30

3.6. Loại bỏ Tris bằng phương pháp kết tủa protein 32

3.7. Kiểm tra hiệu quả loại Tris trên bản điện di 2-DE 34

3.8. Nhận dạng các protein bền nhiệt trên gel bằng hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS 36

3.9. Tìm hiểu chức năng một số protein bền nhiệt đã được nhận diện 37

3.9.1. Haptoglobin 37

3.9.2. Apolipoprotein A (Apo) 38

3.9.3. Transthyretin (TTR) 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

MỞ ĐẦU

Huyết thanh là một hệ protein phức tạp, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Những thay đổi về hàm lượng cũng như thành phần các protein trong huyết thanh thường có mối liên hệ chặt chẽ với các quá trình bệnh lý. Vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là một trong những cách tiếp cận đuợc quan tâm nhất trong nghiên cứu proteomics hiện nay. Tuy nhiên, thách thức lớn nhất trong nghiên cứu protein huyết thanh không chỉ ở số lượng rất lớn protein có mặt (khoảng 10000 loại), mà còn là tỷ lệ rất khác nhau của chúng. Trong khi một số protein có nồng độ cao như albumin (50%-70%), immunoglobulin (8%-10%)…, thì ngược lại, có rất nhiều protein, peptid có nồng độ rất thấp (ng/ml) như cytokin, hormon mà tổng nồng độ của chúng chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số. Những khác biệt rất lớn về nồng độ này cùng với sự hạn chế về mặt kỹ thuật của những phương pháp proteomics truyền thống (định lượng và định tính protein) đã làm cho việc nghiên cứu một số phân đoạn protein có hàm lượng thấp trong huyết thanh trở nên khó khăn và ít được chú ý trong một thời gian dài. Song gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp nghiên cứu proteomics hiện đại với độ nhạy và độ chính xác cao đã cho phép các nhà nghiên cứu phân tách, nhận diện được nhiều protein tồn tại với hàm lượng tới fg/mL. Một số thành phần protein hàm lượng thấp trong huyết thanh đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn.

Một trong những hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực này là nghiên cứu phân đoạn protein bền nhiệt trong huyết thanh. Mặc dù chưa có được nhiều thành tựu lớn, nhưng những kết quả mới công bố gần đây cũng đã gợi ý những phương pháp thu nhận, phân tích và nhận dạng có hiệu quả các protein huyết thanh bền nhiệt, đồng thời cũng chứng minh được có những mối liên hệ nhất định giữa sự biến đổi tính bền nhiệt của các protein này với các quá trình bệnh lý, đặc biệt là đái tháo đường và ung thư. Các nghiên cứu trên hệ protein bền nhiệt này hiện còn rất mới, rất tiềm năng và hứa hẹn sẽ thu được nhiều thành tựu quan trọng và có ý nghĩa trong nghiên cứu sinh - y học.

Trong khóa luận tốt nghiệp này, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di hai chiều 2-DE và khảo sát một số điều kiện thực nghiệm có liên quan để thực hiện đề tài “Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều” với mục tiêu thu nhận, phân tách và bước đầu nhận dạng, tiến tới xây dựng cơ sở dữ liệu về hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh người Việt Nam, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn trên hệ protein này, đặc biệt là trên các mẫu bệnh lý nhằm phân tích, so sánh và tìm kiếm các ứng viên chỉ thị bệnh đặc hiệu.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày ở trên, chúng tôi xin đưa ra một số kết luận và kiến nghị như sau:

Kết luận

1. Bằng các phương pháp biến tính nhiệt của Goufman, đã xử lý và thu nhận thành công phân đoạn chứa các protein bền nhiệt trong huyết thanh người, phục vụ cho các nghiên cứu proteomics.

2. Thông qua quá trình khảo sát, đánh giá và tối ưu hóa đã đề ra được 2 chiến lược hợp lý và hiệu quả nhằm phân tích hệ protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều 2-DE trên các thanh Strip có kích thước và dải pH khác nhau.

3. Kết quả điện di 2-DE thành công đã tạo điều kiện cho việc nhận dạng các protein bền nhiệt bằng khối phổ theo hướng kết hợp điện di hai chiều 2-DE với sắc ký lỏng nano một chiều, ion hóa bằng nguồn ESI và nhận dạng bằng khối phổ liên tục MS/MS (2DE-1DnanoLC-ESI-MS/MS). Danh sách 7 protein bền nhiệt đã được nhận dạng hoàn toàn phù hợp với các công bố hiện có về hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh và với các cơ sở dữ liệu hiện có về protein huyết thanh.

Kiến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện phương pháp nghiên cứu hệ protein huyết thanh bền nhiệt, mở rộng việc khảo sát các protein này trên các dài pH hẹp hơn và kích thước lớn hơn nhằm đánh giá đầy đủ và xây dựng cơ sở dữ liệu hoàn chỉnh về các protein bền nhiệt ở người Việt Nam bình thường, đóng góp vào các công bố về danh sách protein người theo sáng kiên của tổ chức HUPO thế giới.

2. Tiếp tục nghiên cứu hệ protein bền nhiệt trên các đối tượng khác nhau, đặc biệt quan tâm đến các nhóm bệnh lý như ung thư, đái tháo đường, …., phân tích, so sánh nhằm tìm ra những thay đổi trong biểu hiện giữa người thường với người bệnh, tạo cơ sở cho việc tìm kiếm các ứng viên chỉ thị protein phục vụ cho điều trị và chẩn đoán.

3. Tiếp tục nghiên cứu các protein bền nhiệt theo hướng phân tích về mặt cấu trúc nhằm lý giải nguyên nhân làm nên tính bền nhiệt, những thay đổi cấu trúc liên quan đến tính bền nhiệt và ứng dụng những hiểu biết đó vào việc phát triển công nghệ protein.