PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1. Công nghệ sản xuất thực vật bằng nuôi cấy mô

[*]Lịch sử và thành tựu đạt được trong nhân giống invitro ở thực vật

1.1.1.1. Trên thế giới

Năm 1902: Haberlandt đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào đơn bội tuy nhiên chưa mang lại thành công mỹ mãn.

Năm 1934 mô thực vật mới được cấy bởi A Carrel.

Năm 1939,1943,1945: Lần lượt Nobeccourt, White, Gautheret đã công bố thành công sớm nhất về phương pháp nuôi cấy mô trên môi trường thạch.

Theo tiến sĩ White (1943) thì lịch sử của nuôi cấy mô tế bào thực vật đã có từ lâu và mang ý nghĩa quan trọng trong lịch sử phát triển sinh học, tiềm năng của nó được ứng dụng trong việc cải tiến chất lượng và nhân nhanh giống cây trồng.

Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi.

Năm 1960: Tiến sĩ Morel là người bắt đầu phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Ông là người đã đưa ra kỹ thuật nuôi cấy mô địa lan phát triển thành qui mô công nghiệp và nghiên cứu thành công cây nho sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy mô(1945-1948).

Năm 1962, Murathige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay.

Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn.

Năm 1981: Takayama và Misawa đã thành công trong tự động hoá vi nhân giống bằng các hệ thống bioreactor. Đến nay, ngành nuôi cấy mô đã khẳng định vai trò quan trọng của mình bằng một kho tàng đồ sộ các công trình nghiên cứu của mình về thưc vật in vitro.

Đầu thế kỉ 21, hàng loạt các công ty về vi nhân giống cây trồng thương mại với qui mô lớn lần lượt ra đời trên khắp thế giới con số lên đến hơn 600 công ty. Như vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô đã thực sự mở ra một cuộc các mạng trong nhân giống thực vật.

1.1.1.2. Ở Việt Nam

Từ những năm 1960 công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được du nhập vào nước ta bắt đầu tại miền Nam.

Đến đầu những năm 1970 thì đã có tại miền Bắc.

Sau 1975, phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào đầu tiên được xây dựng tại viện Sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu.

Hiện nay, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển mạnh: dung hợp cây lai tế bào chất và chuyển gen, nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần, nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng các chất sinh học.

Tuy nhiên chỉ từ cuối những năm 1980 trở lại đây công nghệ mô - tế bào mới phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng, nhiều phòng thí nghiệm, nghiên cứu đã được xây dựng và triển khai ở hầu khắp các tỉnh thành trong cả nước như: Hà Nội Thành Phố Hồ Chí Minh, Đà Nẵng, Bình Định, . Lĩnh vực áp dụng rộng rãi của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là: bảo quản nguồn gen cây trồng, sự nhân giống vô tính trên qui mô lớn, tạo hạt nhân tạo, sản xuất cây giống sạch bệnh

Nhu cầu cây giống trồng rừng nhân giống bằng phương pháp vô tính như cây: xoan ta, chò chỉ, cáng lò, dó bầu . đang ngày càng phát triển, đòi hỏi phải đầu tư nghiên cứu xây dựng các quy trình công nghệ nhân giống bằng nuôi cấy mô. Bên cạnh đó, phong trào trồng các loại hoa mang tính hàng hóa như phong lan, đồng tiền, cúc . đang ngày càng phát triển cũng đòi hỏi nguồn cây giống vô tính lớn, đồng nhất mà chỉ có sản xuất bằng công nghệ nuôi cấy mô - tế bào mới đáp ứng được.

[*]Phương pháp nhân giống vô tính invitro ở thực vật

[*]Nhân giống vô tính invitro ở thực vật

Định nghĩa

Nhân giống vô tính invitro ở thực vật hay còn gọi là nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đây là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm.

Ưu điểm

Kĩ thuật invitro mở ra khả năng lai khác loài để tạo ra giống mới và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền, tạo dòng cây sạch bệnh.

Phục tráng giống cây trồng bị bệnh.

Nhân nhanh, tăng nhanh hệ số nhân giống, làm trẻ trung hóa cây trồng.

Sản phẩm cây giống đồng nhất, nâng cao chất lượng cây giống, tiết kiệm không gian.

Dễ vận chuyễn và sản xuất quanh năm.

Đối với một số loài cây trồng có giá trị thương mại lớn, kĩ thuật nuôi cấy invitro đã đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt.

Hạn chế của nhân giống vô tính invitro

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện hiện nay không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn đề liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật invitro vẫn chưa được giải đáp.

Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kĩ thuật thành thạo nên giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.

Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống nhưng có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và làm tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng.

Ứng dụng của phương pháp nhân giống vô tính invitro

Thời gian ngắn ( 1-3 năm ): vi nhân giống, sản xuất và bảo quản cây sạch bệnh.

Thời gian trung bình ( 3-8 năm ): biến dị di truyền, nuôi cấy phôi soma, cứu phôi và lai tạo giống qua nuôi cấy đơn bội.

Thời gian dài ( 8-15 năm ): lai tế bào soma và siêu sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học.

[*]Các phương pháp nhân giống invitro ở thực vật

[*]Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chóp đỉnh và chồi bên. Sau khi vô trùng mẫu, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Môi trường thích hợp sẽ thay đổi theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy nhưng cơ bản môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ, hữu cơ và được bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp.

Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian nuối cấy nhất định sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi. Sau đó, chồi sẽ tiếp tục vươn thân, ra lá, ra rễ và trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất có điều kiện phát triển bình thường. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường.

Dùng để tạo ra dòng cây sạch bệnh, hoàn toàn không có virus với hệ số nhân giống cao. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ có thể thực hiện được ở một số loài thực vật nhất định.

[*]Nuôi cấy mô sẹo

Trong điều kiện sự cân bằng các chất kích thích sinh trưởng trong thực vật thay đổi, cụ thể trong tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra nuôi cấy riêng rẽ trên môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành.

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, có màu trắng. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo.

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.

Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhưng phương pháp này tạo ra mức độ biến dị tế bào lại cao hơn.

[*]Gieo hạt lan nẩy mầm trong điều kiện in-vitro, rồi tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Thường sau khi thụ tinh, một cây lan cần thời gian từ 6 tháng đến 1 năm để quả chín. Thông thường hạt lan tung ra và phát tán nhờ gió. Tuy nhiên, hạt lan rất khó nẩy mầm trong tự nhiên (chỉ nẩy mầm từ 1-2%) do hạt lan không có chứa anbumin và một phôi chưa phân hóa, có kích thước rất nhỏ nên không chứa chất dự trữ. Vì vậy trong tự nhiên để hạt lan nẩy mầm nó cần cộng sinh với nấm. Có 3 loại nấm cộng sinh trên nhiều giống lan khác nhau được biết:

Rhizoctonia repéns đặc biệt cho Cattleya, Laelie, Cypripedium

Rhizoctonia mucoroides cho Vanda và Phalaenopsis

Rhizoctonia lanuginosa cho Oncidium, Miltonia

Nấm sẽ cung cấp đường để nuôi cây, phân giải các chất hữu cơ khó hấp thu. Bù lại cây sẽ cung cấp nước cho nấm, chỗ ở, các khoáng chất mà nó thu được từ sương.

Dựa trên nguyên tắc này, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô đã tạo môi trường gieo hạt lan trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo có khoáng, đường và hạt lan nảy mầm với tỷ lệ rất cao. Hiện nay, phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp duy nhất có thể nhân giống lan trên qui mô công nghiệp.

Trái lan khi hái phải đủ già và chưa bị nứt được đem khử trùng. Môi trường cấy chuyền là môi trường gieo hạt nhưng bổ sung thêm 10% nước dừa cho protocorm phát triển nhanh.

Khi chồi đã lớn chuyển sang môi trường như môi trường cơ bản, sau khoảng 6 - 7 tháng tùy giống khi cây cao từ 4-5 cm, ra rễ và có từ 4 - 5 lá là có thể mang ra ngoài trồng