TÓM TẮT

PHẠM DUY, HUỲNH VĂN THÁI, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α”, 8-2005.

Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn.

Đế tài được thực hiện từ 01/03/2005 đến 15/08/2005 với các nội dung:

Xây dựng phương pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phương pháp sử dụng hoá chất.

Hoàn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α

Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra.

Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript.

Thực hiện kiểm tra kết quả chèn bằng enzym cắt giới hạn và phản ứng PCR trên plasmid tái tổ hợp với cặp primers T3 T7 dựa trên vùng trình tự T3 T7 PNA polymerase và cặp primers ITS4 ITS5 dựa trên vùng trình tự ITS của nấm Beauveria bassiana.

Kết quả thu được như sau:

Thiết lập được quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hoá chất, tế bào khả nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng.

Biến nạp plasmid mang đoạn DNA vào vi khuẩn E.coli DH5α.

Chiết tách plasmid không lẫn tạp theo quy trình của Sambrook và cộng sự có sửa đổi.

Kết quả kiểm tra phản ứng nối bằng phương pháp PCR trên plasmid cho thấy đã chèn được đoạn DNA (629bp) chứa gen mã hoá 2,4-diacetylploroglucinol (2,4-DAPG) trong vi khuẩn Psedomonas fluorescens và đoạn DNA (580bp) trong vùng ITS của loài nấm Beauveria bassiana vào plasmid.

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt Vấn Đề

Cách đây hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đúng khi nhận thấy việc sử dụng DNA tái tổ hợp như là một công cụ hữu hiệu trong việc nâng cao năng suất cây trồng và chất lượng lương thực, thực phẩm đồng thời vẫn thúc đẩy được một nền nông nghiệp bền vững. Tiếp theo những nhận định này là hàng loạt những đột phá trong nghiên cứu khoa học về các phương pháp chuyển gen, trong việc phát hiện và bảo tồn những gen quý.

Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thường gặp khó khăn

lớn về số lượng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề

này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt đông của gen, sự biểu hiện

ra protein và cấu trúc của protein, người ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận

đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lượng lớn để tiến hành nghiên

cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta

quan tâm thường chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không

thể sử dụng các phương pháp sinh hoá thông thường để phân lập gen mục tiêu trên bộ

gen.

Những vấn đề trên có thể được giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phương tiện mang gen, biến nạp gen, tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ thường được chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp được phân lập để lưu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu được số lượng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu.

Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về

kĩ thuật di truyền được tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài “ Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α” trong khoá luận tốt nghiệp của mình.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Thiết lập quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescipt và chuyển được plasmid tái tổ hợp này vào tế bào ký chủ Ecoly DH5α.

1.3 Nội dung thực hiện

1.3.1 Phần 1

Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD600nm và mật số tế bào vi khuẩn dựa trên sự tương quan của số tế bào theo thời gian nuôi cấy kết hợp với tương quan của giá trị OD600nm theo thời gian nuôi cấy.

Thiết lập quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất.

Thiết lập phương pháp biến nạp plasmid DNA chưa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn

E.coly DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt.

Phương pháp tách chiết plasmid chưa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp, kết hợp với phản ứng cắt enzym giới hạn để kiểm tra.

1.3.2 Phần 2

Chuẩn bị đoạn DNA để chèn.

Cắt và tinh sạch vector.

Phản ứng sửa chữa sai sót trên đoạn DNA chèn, nhằm tạo ra đoạn DNA có đầu

bằng.

Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn.

Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào.

Kiểm tra thể biến nạp trên môi trường có chứa Ampicillyn, X-gal, IPTG

Kiểm tra lại kết quả biến nạp đoạn gen bằng phản ứng cắt, phản ứng PCR trên plasmid tách chiết từ thể biến nạp