TÓM TẮT

“PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR”.

Đề tài “Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - time PCR” được thực hiện tại Công Ty Nam Khoa và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh từ ngày 01/ 03/ 05 đến ngày 01/ 08/ 05. Đề tài được thực hiện trên đối tượng là virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú. Virus này gây dịch bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng tôm sú nuôi (Penaeus monodon) trên thế giới và ở nước ta. Sử dụng kỹ thuật Real - time PCR trong phát hiện và định lượng WSSV trên tôm sú ở các giai đoạn nuôi nhằm phát hiện nhanh, chính xác; định lượng WSSV trên các mẫu tôm sú; góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát dịch bệnh đốm trắng.

Những kết quả đạt được:

ã Xác định được quy trình ly trích ADN phù hợp cho phản ứng Real – time PCR và Non Stop Nested PCR.

ã Ứng dụng thành công phương pháp Real - time PCR để phát hiện và định lượng số bản sao của virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú.

ã Xác định khả năng định lượng chính xác của phương pháp Real – time với độ lặp lại cao.

ã Xác định được độ nhạy của phương pháp Real - time PCR so với Non Stop Nested PCR

ã Ứng dụng Real - time PCR để phát hiện và định lượng WSSV trên 30 mẫu tôm sú thu từ thực tiễn ở các giai đoạn nuôi, có 22 mẫu bị nhiễm WSSV từ rất nhẹ đến nặng và 8 mẫu âm tính về bệnh đốm trắng.

ã Bước đầu đánh giá về khả năng thành công của các ao thả nuôi tôm bị nhiễm WSSV.

SUMMARY

PHAM THI MY HANH, Nong Lam University. August, 2005. “DETECTION AND QUANTIFICATION OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) BY USING REAL – TIME PCR”.

Guidance council:

Ms. PHAN THI NGOC THUY

Ms. NGUYEN THAI THUY

Thesis “Detection and Quantification of White Spot Syndrome Virus (WSSV) in Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon) by Using Real - time PCR” was carried out in Nam Khoa company and at Chemical & Biological Analysis and Experiment Center of Nong Lam University from March 1st, 2005 to August 1st, 2005. The object of the thesis is White Spot Syndrome Virus (WSSV) in black tiger shrimp. This virus has caused an epidermic viral disease outbreak occurred on cultured black tiger shrimp (Penaeus monodon) which had caused severe economic losses to the shrimp production in Vietnam and around the world. Using Real – time PCR for detection and quantification WSSV in cultured black tiger shrimp at all stages aims to rapidly, precisely detect and quantify WSSV in cultured black tiger shrimp in order to prevent the occurrence and outspread of the disease outbreak.

My obtained results include:

ã An appropriate DNA extraction protocol for Real - time PCR and Non Stop Nested PCR reactions.

ã Successful application of Real - time PCR to detect and quantify WSSV in black tiger shrimp.

ã Capacity of precise WSSV quantification of Real - time PCR with highly repeated results.

ã Comparision the sensitivity of Real - time PCR with Non Stop Nested PCR.

ã Application of Real - time PCR to detect and quantify WSSV in 30 collected samples of cultured black tiger shrimp at all stages. The result indicated that there are 22 samples infected with WSSV from very light to severe infection and 8 samples uninfected with WSSV.

ã Preliminary evaluation of the success of cultured ponds stocked with WSSV infected shrimp seeds or cultured shrimp infected with WSSV.

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các hình xii

Danh sách các bảng xv

1. MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục đích yêu cầu 2

1.2.1. Mục đích 2

1.2.2. Yêu cầu 2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Giới thiệu khái quát về tôm sú (Penaeus monodon) 3

2.1.1. Phân loại 3

2.1.2.Vùng phân bố 3

2.1.3. Chu kỳ sống 4

2.2. Tình hình dịch bệnh WSSV trên thế giới và Việt Nam 5

2.2.1. Trên thế giới 5

2.2.2. Ở Việt Nam 5

2.3. Bệnh đốm trắng trên tôm 7

2.3.1. Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) 7

2.3.1.1. Định danh và phân loại 7

2.3.1.2. Đặc điểm hình thái 8

2.3.1.3. Đặc tính sinh học 8

2.3.2. Vật chủ mang mầm bệnh WSSV 9

2.3.3. Các con đường lây truyền WSSV 9

2.3.4. Cơ chế xâm nhập 10

2.3.5. Triệu chứng của bệnh 10

2.3.6. Phương pháp chẩn đoán 11

2.4. Phương pháp PCR và các cải tiến 12

2.4.1. Phương pháp PCR 12

2.4.1.1. Nguyên tắc 12

2.4.1.2. Các thành phần của phản ứng PCR 13

2.4.1.3. Các bước phản ứng 13

2.4.1.4. Ứng dụng 14

2.4.1.5. Ưu và nhược điểm 14

2.4.2. Kỹ thuật Nested PCR 15

2.4.2.1. Nguyên tắc 15

2.4.2.2. Ưu và nhược điểm 16

2.4.3. Kỹ thuật Real - time PCR 16

2.4.3.1. Lịch sử phát triển 16

2.4.3.2. Khái niệm 17

2.4.3.3. Nguyên tắc 17

2.4.3.4. Hệ thống Real - time PCR 17

2.4.3.5. Phương pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR 18

2.4.3.6. Nguyên lý định lượng của kỹ thuật Real - time PCR 22

2.4.3.7. Ưu và nhược điểm 23

2.4.3.8. Ứng dụng 23

3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

3.1.1. Thời gian thực hiện 25

3.1.2. Địa điểm thu mẫu 25

3.1.3. Địa điểm phân tích mẫu 25

3.2. Nội dung nghiên cứu 25

3.3. Nguyên vật liệu 25

3.3.1. Mẫu xét nghiệm 25

3.3.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất 26

3.3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ 26

3.3.2.2. Hoá chất 27

3.4. Phương pháp nghiên cứu 28

3.4.1. Thu mẫu và bảo quản mẫu 28

3.4.2. Ly trích mẫu 28

3.4.2.1. Pha dung dịch tách chiết 28

3.4.2.2. Tiến hành ly trích 29

3.4.3. Tiến hành thực hiện Real - time PCR 30

3.4.3.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Real - time PCR 30

3.4.3.2. Thiết lập chương trình thực hiện Real - time PCR trên phần

mềm máy iCycler iQ 30

3.4.3.3. Chạy Real - time PCR 31

3.4.3.4. Phân tích kết quả trên màn hình máy vi tính 31

3.4.4. Thực hiện Non Stop Nested PCR 33

3.4.4.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Non Stop Nested

PCR 33

3.4.4.2. Thiết lập chương trình thực hiện Non Stop Nested PCR

trên phần mềm của máy iCycler 33

3.4.4.3. Chạy Non Stop Nested PCR 33

3.4.4.4. Điện di và phân tích kết quả 34

3.4.5. Cách đọc kết quả 36

3.4.5.1. Real - time PCR 36

3.4.5.2. Non Stop Nested PCR 39

3.5. Bố trí thí nghiệm 40

3.5.1. Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH,

sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene

Matrix 40

3.5.2. Thí nghiệm 2: sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát

hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dương tính,

âm tính với WSSV 41

3.5.3. Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time

PCR 42

3.5.4. Thí nghiệm 4: khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real - time PCR

và Non Stop Nested PCR 43

3.5.5. Thí nghiệm 5: ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra

mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế 43

3.5.6. Thí nghiệm 6: theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã

được thu mẫu kiểm tra 44

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1. Kết quả thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt

và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene

Matrix 45

4.2. Kết quả sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện virus

gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính

với WSSV 46

4.3. Kết quả khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time PCR 53

4.4. Kết quả khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real - time PCR và Non

Stop Nested PCR 57

4.5. Kết quả ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh

WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế 60

4.6. Kết quả theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã được thu

mẫu kiểm tra 67

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70

5.1. Kết luận 70

5.2. Đề nghị 70

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

7. PHỤ LỤC 75

Phụ lục A TRỌNG LƯỢNG MẪU LY TRÍCH 75

Phụ lục B HÌNH ẢNH VÀ SỐ LIỆU THÔ KẾT QUẢ CHẠY REAL – TIME

PCR VÀ NON STOP NESTED PCR 76

Phụ lục C CÁC THUẬT TỪ THƯỜNG DÙNG TRONG REAL – TIME

PCR 88

Phụ lục D CÁC BƯỚC VẬN HÀNH MÁY iCycler iQ 90

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR