MỤC LỤC

CHưƠNG TRANG

Trang tựa .i

Lời cảm ơn .iii

Tóm tắt .iv

Summary vi

Mục lục .vii

Danh sách các bảng .xi

Danh sách các hình và sơ đồ .xiii

Danh sách các chữ viết tắt xv

CHưƠNG 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề . 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu .2

1.3. Yêu cầu .2

CHưƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây .3

2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp .3

2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp .4

2.2. Alkaloid .4

2.3. Sơ lược đặc điểm về cây Trường xuân hoa Catharanthus roseus 7

2.3.1. Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa .7

2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa .8

2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa 9

2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa 13

2.3.5. Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa . 13

2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh 14

2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp .15

2.4.1. Các chất điều hòa sinh trưởng . 15

2.4.2. Nguồn đạm 16

2.4.3. Nguồn cacbon 16

2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen 16

2.4.5. Các chất khác 16

2.5. Các phương pháp chiết xuất alkaloid 17

2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất 17

2.5.2. Phương pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ 17

2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước . 18

2.6. Các phương pháp định tính sự hiện diện của alkaloid 18

2.6.1. Phản ứng tạo tủa 19

2.6.2. Phản ứng tạo màu 19

2.7. Các phương pháp định lượng alkaloid .20

2.7.1. Phương pháp cân .20

2.7.2. Phương pháp trung hòa 20

2.7.3. Định lượng alkaloid trong môi trường khan .21

2.7.4. Phương pháp so màu .21

2.7.5. Các phương pháp định lượng alkaloid hiện đại 22

2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp .22

2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản 22

2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp .23

2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao 24

2.8.2. Xử lý với Elicitor 24

2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học 24

2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất 24

2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học .25

CHưƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Nội dung nghiên cứu 26

3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA lên sự

sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .26

3.3.1. Vật liệu 26

3.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .26

3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ .26

3.3.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy .26

3.3.3. Phương pháp nghiên cứu .27

3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây

Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA .27

3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA

đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27

3.3.4. Phương pháp tiến hành 29

3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trường

xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA 29

3.4.1. Vật liệu .29

3.4.1.1. Mẫu kiểm tra 29

3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 29

3.4.1.3. Hóa chất .30

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu .30

3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây

Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner 30

3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây

Trường xuân hoa 31

3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng alkaloid của cây

Trường xuân hoa in vitro và cây Trường xuân hoa in vivo .31

3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lượng alkaloid trong cây

Trường xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE .32

3.4.3. Phương pháp tiến hành 32

3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa 32

3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trường xuân hoa 32

3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lượng alkaloid bằng CE 34

CHưƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35

CHưƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56

5.1. Kết luận .56

5.2. Đề nghị .57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây 13

Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự

sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27

Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh

trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28

Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự

sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28

Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35

ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .35

Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35

ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36

Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35

ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của

cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy .37

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của

cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy .38

N1

N3

N2 I2

Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa

in vitro bằng thuốc thử Wagner 41

Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa

in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 43

Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa

in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 46

Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và

mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE .50

Bảng 4.10. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây

Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE 53

Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây

Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy .54

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid 7

Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa 7

Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa .8

Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine . 10

Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline 10

Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine . 11

Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây

Trường xuân hoa từ tiền chất 12

Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung

NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy .39

Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu cây

Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày 42

Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường

xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA .42

Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân

lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA .44

Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá

của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA 45

Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây

Trường xuân hoa in vitrotrên môi trường có chứa NAA 46

Hình 4.7:Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây

Trường xuân hoa in vitrotrên môi trường có chứa IAA 47

Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l, vindoline 20 mg/l 48

Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu

Trường xuân hoa in vivo tươi 49

Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu

Trường xuân hoa in vivo khô 50

xii