Phần 1. MỞ ĐẦU 1

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU – PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT 3

2.1 Lịch sử phát triển của phương pháp Southern blot 3

2.2 Nguyên tắc của phương pháp Southern blot 4

2.3 Một số ứng dụng của phương pháp Southern blot 4

2.4 Sự khác nhau giữa Southern blot, Northern blot, và Western blot 5

2.5 Một số phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn 5

2.5.1 Phương pháp sử dụng SDS 6

2.5.2 Phương pháp sử dụng CTAB 7

2.5.3 Phương pháp sử dụng Phase Lock Gel TM (Jones và Bartlet, 1990) 8

2.6 Một số phương pháp định tính và định lượng DNA 9

2.6.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế 9

2.6.2 Điện di (Electrophoresis) 10

2.6.3 Định lượng DNA bằng phân tử Mass 11

2.7 Enzyme giới hạn (Restriction enzyme) 12

2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn 12

2.7.2 Các loại enzym giới hạn 13

2.7.3 Các kiểu cắt của enzym giới hạn 13

2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng 15

2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 15

2.8.1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA Polymerase 16

2.8.2 Ứng dụng phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn Pseudomonas fluorescense định cư trong đất và trong vùng rễ cây trồng 16

2.9 Phương pháp tinh sạch DNA 17

2.9.1 Phương pháp tinh sạch DNA bằng phenol 17

2.9.2 Phương pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX 17

2.10 Các phương pháp chuyển DNA lên màng 19

2.10.1 Phương pháp mao dẫn hướng lên (Upward Capillary Transfer) 19

2.10.2 Phương pháp mao dẫn hướng xuống (Downward Capillary Transfer) 21

2.10.3 Phương pháp mao dẫn hai chiều

(Simultaneous Transfer to Two Membranes) 21

2.10.4 Phương pháp chuyển bằng điện (electrophoresis transfer) 22

2.10.5 Phương pháp chuyển bằng chân không 23

2.11 Đánh dấu probe 24

2.11.1 Tác nhân đánh dấu 24

2.11.1.1 Hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ 24

2.11.1.2 Hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ 25

2.11.2 Phương pháp đánh dấu 29

2.11.2.1 Phương pháp nick – translation 29

2.11.2.2 Phương pháp random priming (thiết lập mồi ngẫu nhiên) 30

2.11.2.3 Phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi) 32

2.11.2.4 Phương pháp photobiotin 32

2.12 Các phương pháp lai phân tử 35

2.12.1 Cơ sở của sự lai phân tử 35

2.12.1.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA 35

2.12.1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA 36

2.12.1.3 Khái niệm về lai phân tử 37

2.12.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử 37

2.12.2 Các kiểu lai phân tử 37

2.12.2.1 Lai trong pha lỏng 37

2.12.2.2 Lai trên pha rắn 38

2.12.2.3 Lai tại chổ (in situ hybridization) 39

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

3.1 Thời gian và địa điểm 40

3.2 Nội dung nghiên cứu 40

3.3 Phương pháp nghiên cứu 40

3.3.1 Vật liệu thí nghiệm 40

3.3.2 Phương pháp tiến hành 43

3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB 42

3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 42

3.3.2.3 Hiệu chỉnh nồng độ và định lượng DNA bằng phân tử Mass 45

3.3.2.4 Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng ezyme giới hạn 46

3.3.2.5 Thực hiện phản ứng PCR trên hai cặp primer B2BF, BRR4 48

3.3.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel 50

3.3.2.7 Thực hiện đánh dấu sản phẩm PCR của cặp primer B2BF, BRR4. 51

3.3.2.8 Tạo mẫu lai 52

3.3.2.9 Lai Southern 55

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57

4.1 Kết quả tăng sinh, ly trích và định lượng DNA 57

4.1.1 Kết quả ly trích genomic DNA 57

4.1.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ 58

4.1.3 Kết quả định lượng bằng phân tử Mass 59

4.2 Kết quả phản ứng cắt DNA bằng enzyme giới hạn 59

4.3 Kết quả phản ứng PCR với hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b 61

4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel 62

4.5 Kết quả lai Southern 63

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69

5.1 Kết luận 69

5.2 Đề nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

Phụ lục 1 77

Phụ lục 2 79

Phụ lục 3 8