Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) Việt Nam BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đinh Thị Phương Anh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÂY BẠCH TRINH BIỂN (HYMENOCALLIS LITTORALIS) VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2014  TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đinh Thị Phương Anh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÂY BẠCH TRINH BIỂN (HYMENOCALLIS LITTORALIS) VIỆT NAM   : 62440114    1. PGS. TS.  2. TS.  - 2014 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Thực vật họ Thủy tiên (Amaryllidaceae), chi Bạch trinh (Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 3 1.1.1. Thực vật họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) 3 1.1.2. Thực vật chi Bạch trinh (Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 3 1.2. Thành phần hóa học họ Thủy tiên (Amaryllidaceae), chi Bạch trinh (Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 6 1.2.1. Thành phần hóa học họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) 6 1.2.2. Thành phần hóa học chi Bạch trinh (Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 11 1.3. Hoạt tính sinh học của họ Thủy tiên (Amaryllidaceae), chi Bạch trinh (Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 27 1.3.1. Hoạt tính sinh học của họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) 27 1.3.2.Hoạt tính sinh học của chi Bạch trinh (Hymenocallis) và loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 30 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 33 2.1. Mẫu thực vật 33 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 33 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 33 2.2.2. Sắc ký cột (CC) 33 2.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 33 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 33 2.3.1. Phổ hồng ngoại (FT-IR) 34 2.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS) 34 2.3.3. Phổ khối lượng phân giải cao (FT-ICR-MS) 34 2.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 34 2.3.5. Điểm nóng chảy 34 2.3.6. Độ quay cực riêng 34 2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 35 2.5. Phân lập các hợp chất 35 2.5.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách cây Bạch trinh biển 35 2.5.2. Phân lập các hợp chất từ cặn HLF 36 2.5.2.1. Phân lập các hợp chất HLB2, HLB4, HLB5 từ cặn HLF 36 2.5.2.2. Phân lập các hợp chất HLB1, HL53, HLB12, HLB13 và HLB14 38 2.5.3. Phân lập các hợp chất 41 2.5.3.1. Phân lập các hợp chất HLB8, HLB9, HLB10 và HL22 41 3.5.3.2. Phân lập các hợp chất HLB6, HLB7, HLB11 và HLB17 42 2.6. Chuyển hóa một số alkaloid 44 2.6.1. Axetyl hóa tazettine 44 2.6.2. Axetyl hóa lycorine 45 2.6.3.Axetyl hóa haemanthamine 45 2.7. Hằng số vật lý và các dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập 46 2.7.1. Hợp chất HLB1 46 2.7.2. Hợp chất HLB2 47 2.7.3. Hợp chất HLB4 47 2.7.4. Hợp chất HLB13 48 2.7.5. Hợp chất HL53 49 2.7.6. Hợp chất HLB5 49 2.7.7. Hợp chất HLB12 50 2.7.8. Hợp chất HLB14 50 2.7.9. Hợp chất HLB6 51 2.7.10. Hợp chất HLB7 51 2.7.11. Hợp chất HLB8 52 2.7.12. Hợp chất HLB9 53 2.7.13. Hợp chất HLB10 54 2.7.14. Hợp chất HLB11 54 2.7.15. Hợp chất HLB17 55 2.7.16. Hợp chất HL22 56 2.8. Hằng số vật lý và các dữ liệu phổ của các dẫn xuất axetyl hóa các alkaloid. 57 2.8.1. Hợp chất TA2 57 2.8.2. Hợp chất LY1 58 2.8.3. Hợp chất LY2 58 2.8.4. Hợp chất HA1 59 2.9. Hoạt tính sinh học của các cặn chiết, hợp chất đã phân lập và bán tổng hợp 60 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63 3.1. Mẫu thực vật 63 3.2. Phân lập các hợp chất 63 3.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được từ cây Bạch trinh biển 63 3.3.1. Hợp chất HLB1 63 3.3.2. Hợp chất HLB2 66 3.3.3. Hợp chất HLB4 68 3.3.4. Hợp chất HLB13 69 3.3.5. Hợp chất HL53 (chất mới) 71 3.3.6. Hợp chất HLB5 78 3.3.7. Hợp chất HLB12 79 3.3.8. Hợp chất HLB14 81 3.3.9. Hợp chất HLB6 82 3.3.10 Hợp chất HLB7 84 3.3.11 Hợp chất HLB8 86 3.3.12. Hợp chất HLB9 88 3.3.13. Hợp chất HLB10 90 3.3.14. Hợp chất HLB11 92 3.3.15. Hợp chất HLB17 93 3.3.16. Hợp chất HL22 (chất mới) 95 3.4. Tổng hợp các dẫn xuất của một số alkaloid phân lập được từ cây Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis). 102 3.4.1. Hợp chất TA2 105 4.4.2.Hợp chất LY1 107 4.4.3.Hợp chất LY2 108 4.4.4.Hợp chất HA1 110 3.5. Hoạt tính gây độc tế bào của cây Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 112 3.5.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết, các hợp chất phân lập 113 3.5.1.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết 113 3.5.1.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các flavonoid và chromone 113 3.5.1.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các alkaloid 115 3.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất axetyl hóa các alkaloid 116 KẾT LUẬN 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO 123 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 141 PHỤ LỤC 142 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT h Giờ IC 50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử TBƯT Tế bào ung thư DMSO Dimethyl sunfoxide OD mật độ quang học (Optical Density) SRB Sulforhodamine B FBS Fetal bovine serum NCI National Cancer Institute TCA Trichloracetic acid MeOH Methanol EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetate CHCl 3 Chloroform δ Độ chuyển dịch hóa học J Hằng số tương tác ĐC Đối chứng TLC Thin Layer Chromotography (Sắc ký lớp mỏng) NMR Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) IR Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại) ESI-MS Electrospray Ionisation Mass Spectrometry (Phổ khối lượng thông qua ion hóa điện tử) FT-ICR-MS Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry (Phổ khối lượng phân giải cao) UV Ultraviolet (Tử ngoại) DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1. Cây Bạch trinh biển 5 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết mẫu cây Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 36 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập HLB2, HLB4 và HLB5 37 Sơ đồ 2.3: Sơ đồ phân lập HLB1, HLB53, HLB12, HLB13 và HLB14 39 Sơ đồ 2.4: Sơ đồ phân lập HLB8, HLB9, HLB10 và HL22 41 Sơ đồ 2.5: Sơ đồ phân lập HLB6, HLB7, HLB11 và HLB17 43 Sơ đồ 2.6: Sơ đồ phản ứng axetyl hóa tazettine 44 Sơ đồ 2.7: Sơ đồ phản ứng axetyl hóa lycorine 45 Sơ đồ 2.8: Sơ đồ phản ứng axetyl hóa haemanthamine 46 Hình 3.1: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB1 64 Hình 3.2: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB2 66 Hình 3.3: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB4 68 Hình 3.4: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB13 70 Hình 3.5: Phổ khối lượng ESI-MS của HL53 71 Hình 3.6: Phổ khối lượng FT-CIR-MS của HL53 72 Hình 3.7: Phổ 1 H NMR của HL53 73 Hình 3.8: Phổ 13 C NMR của HL53 74 Hình 3.9: Phổ HSQC của HL53 74 Hình 3.10: Phổ HMBC của HL53 75 Hình 3.11: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HL53 76 Hình 3.13: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB5 78 Hình 3.14: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB12 80 Hình 3.15: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB14 81 Hình 3.16: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB6 83 Hình 3.17: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB7 84 Hình 3.18: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB8 86 Hình 3.20: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB10 90 Hình 3.21: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB11 92 Hình 3.22: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HLB17 94 Hình 3.23: Phổ khối lượng FT-CIR-MS của HL22 96 Hình 3.24: Phổ 1 H NMR của hợp chất HL22 97 Hình 3.25: Phổ 1 C NMR của hợp chất HL22 98 Hình 3.26: Phổ DEPT của hợp chất HL22 98 Hình 3.27: Phổ HSQC của hợp chất HL22 99 Hình 3.28: Phổ HMBC của hợp chất HLB9 100 Hình 3.29: Phổ HMBC của hợp chất HL22 100 Hình 3.30: Tương tác xa HMBC (H→C) và cấu trúc hóa học của HL22 101 Sơ đồ 3.1. Phản ứng axetyl hóa haemanthamine, tazettine và lycorine 104 Sơ đồ 3.2. Cơ chế phản ứng axetyl hóa 104 Hình 3.31: Cấu trúc hóa học của TA2 105 Hình 3.32: Cấu trúc hóa học của LY1 107 Hình 3.33: Cấu trúc hóa học của LY2 109 Hình 3.34: Cấu trúc hóa học của HA1 111 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Các dạng alkaloid trong họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) 7 Bảng 1.2: Một số alkaloid trong chi Hymenocallis 14 Bảng 1.3: Các thành phần dễ bay hơi được khảo sát từ tinh dầu cây Bạch trinh biển 26 Bảng 3.1: Độ chuyển dịch δ 1 H và δ 13 C của HLB1 65 Bảng 3.2: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB2 67 Bảng 3.3: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB4 68 Bảng 3.4: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB13 70 Bảng 3.5: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HL53 77 Bảng 3.6: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB5 79 Bảng 3.7: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB12 80 Bảng 3.8: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB14 82 Bảng 3.9: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB6 83 Bảng 3.10: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB7 85 Bảng 3.11: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB8 87 Bảng 3.12: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB9 88 Bảng 3.13: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB10 91 Bảng 3.14: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB11 92 Bảng 3.15: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HLB17 94 Bảng 3.16: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của HL22 101 Bảng 3.17: Độ chuyển dịch 1 H  và 13 C  của TA2 105 Bảng 3.18: Độ dịch chuyển 1 H  và 13 C  của LY1 107 Bảng 3.19: Độ dịch chuyển 1 H  và 13 C  của LY2 109 Bảng 3.20: Độ dịch chuyển 1 H  và 13 C  của HA1 111 Bảng 3.21: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết 113 Bảng 3.22: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các flavonoid và chromone 114 Bảng 3.23: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các alkaloid 115 Bảng 3.24: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất axetyl 116 1 MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, được thiên nhiên ưu đãi nên có một thảm thực vật rất phong phú và đa dạng. Hiện nay các nhà khoa học đã phát hiện được gần 12.000 loài thực vật bậc cao thuộc hơn 2.256 chi, 305 họ (chiếm 4% tổng số loài, 15% tổng số chi, 57% tổng số họ thực vật trên thế giới); 69 loài thực vật hạt trần; 12.000 loài thực vật hạt kín; 2.200 loài nấm; 2.176 loài tảo; 481 loài rêu; 368 loài vi khuẩn lam; 691 loài dương sỉ và 100 loài khác. Trong đó có 50% số loài thực vật bậc cao là các loài có tính chất bản địa, các loài di cư từ Hymalia - Vân Nam - Quý Châu xuống chiếm 10%, các loài di cư từ Ấn Độ - Myanma sang chiếm 14%, các loài từ Indonesia - Malaysia di cư lên chiếm 15%, còn lại là các loài có nguồn gốc hàn đới và nhiệt đới khác [21] Trong các loài thực vật bậc cao có khoảng gần 4.000 loài được ông cha ta sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền của dân tộc ngay từ cổ xưa [2]. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung, y học nói riêng, nền y học cổ truyền dân tộc đang có những đóng góp to lớn cùng với y học hiện đại góp phần vào việc phòng, chữa bệnh nhằm làm tăng tuổi thọ của con người và chất lượng cuộc sống. Cũng chính vì vậy mà việc điều tra nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc có giá trị cao của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lý, có hiệu quả nhất có trở nên đặc biệt quan trọng. Theo hướng nghiên cứu này, rất nhiều dược phẩm có nguồn gốc từ thảo dược đã được ứng dụng như rutin từ Hoa hòe chữa một số bệnh tim mạch [12]; artemisinin chiết xuất từ cây Thanh hao hoa vàng và rất nhiều dẫn xuất của nó như artemether, arteether, artesunate chữa bệnh sốt rét ác tính [35]; berberin được chiết xuất từ một số loại cây như cây Vàng đắng dùng để chữa bệnh tiêu chảy đường ruột [11]; curcumin được chiết xuất từ củ Nghệ vàng dùng để chữa một số bệnh viêm loét dạ dày và đường tiêu hóa [10]… Ngoài ra, hiện nay còn có viên nang Crila chiết xuất từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum lattifolium) - họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) có tác dụng chữa u xơ tử cung và u xơ tiền liệt tuyến [14, 15]. Việc nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất có nguồn thiên nhiên, đặc biệt là từ nguồn thực vật ngày càng đóng góp phần quan trọng vào sự phát triển của nhiều lĩnh vực của cuộc . 3.5. Hoạt tính gây độc tế bào của cây Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) 112 3.5.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết, các hợp chất phân lập 113 3.5.1.1. Hoạt tính gây độc tế bào. tế bào của các dịch chiết 113 3.5.1.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các flavonoid và chromone 113 3.5.1.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các alkaloid 115 3.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các. các thành phần hóa học khác từ loài Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) của Việt Nam;  Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết tổng alkaloid và các thành phần hóa học khác;