v

TÓM TẮT

Đỗ Thị Ngọc Hân, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, “CHUYỂN GEN

gfp (GREEN FLUORESCENT PROTEIN) VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN

Pseudomonas fluorescens” BẰNG PHưƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH

PHẦN. Đề tài được thực hiên ở Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, thời

gian từ th́ng 02/2006 đến th́ng 08/2006, dưới sự hướng dẫn cuả Thầy Lê Đình Đôn.

Nội dung nghiên cứu

Chọn lọc vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường chọn lọc.

Xây dựng quy trình tiếp hợp plasmid pUT- gfp vào vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens bằng phương ph́p tiếp hợp ba thành phần (triparental mating).

T́ch chiết DNA plasmid pUT-gfp để làm mẫu dò.

Tiến hành phương ph́p Dot Blot để kiểm tra gen đã chuyển.

Xem biểu hiện gen ph́t śng trên kính hiển vi có ph́t huỳnh quang.

Kết quả đạt được

Thiết lập được quy trình tiếp hợp Plasmid pUT- gfp vào vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens bằng phương ph́p tiếp hợp ba thành phần (triparental mating).

Hoàn thiện quy trình kiểm tra gen đã chuyển bằng phương ph́p Dot Blot và xem

lại trên kính hiển vi ph́t huỳnh quang.

vi

MỤC LỤC

Nội dung Trang

LỜI CẢM ƠN .iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC . v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT . ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

DANH SÁCH BẢNG .xi

Phần 1. MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài . 1

1.3 Đối tượng nghiên cứu . 1

1.4 Nội dung thực hiện 2

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

2.1 Sự di chuyển gen và t́i tổ hợp gen ở vi khuẩn . 3

2.1.1 Hiện tượng biến nạp (Transfomation) . 3

2.1.1.1 Định nghĩa . 3

2.1.1.2 Cơ chế hiện tượng biến nạp . 3

2.1.2 Hiện tượng tải nạp (Transduction) 4

2.1.2.1 Định nghĩa . 4

2.1.2.2 Cơ chế hiện tượng tải nạp 4

2.1.3 Hiện tượng tiếp hợp ở vi khuẩn (Conjugation) . 5

2.1.3.1 Định nghĩa . 5

2.1.3.2 Thí nghiệm Lederberg và Tatum (1946) . 5

2.1.3.3 Yếu tố giới tính F . 7

2.1.3.4 Ćc loại vi khuẩn đực mang yếu tố F 8

2.1.3.5 Cơ chế qú trình tiếp hợp 11

2.1.3.6 Lập bản đồ bằng tiếp hợp 11

2.2 V́ch tế bào của vi khuẩn 12

2.2.1 Cấu tạo v́ch tế bào Gram (+) . 13

vii

2.2.2 Cấu tạo v́ch tế bào Gram (-) 13

2.3 Vi khuẩn – t́c nhân phòng trừ sinh học 14

2.4 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 15

2.4.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 15

2.4.2 Ćc nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens . 15

2.5 Plasmid 18

2.6 Transposon 24

2.6.1 Transposon vi khuẩn . 25

2.6.2 Phân loại transposon . 25

2.6.3 Cơ chế chuyển vị 26

2.6.4 Ứng dụng của transposon . 27

2.7 Protein GFP . 28

2.7.1 Cấu trúc và đặc điểm 28

2.7.2 Tình hình nghiên cứu về gen gfp 29

2.8 Phương ph́p đ́nh dấu . 31

2.8.1 Phương ph́p nick – translation 32

2.8.2 Phương ph́p random priming 32

2.8.3 Phương ph́p đ́nh dấu End labelling . 32

2.8.4 Phương ph́p photobiotin 33

2.9 Lai phân tử . 33

2.9.1 Kh́i niệm về lai phân tử . 33

2.9.2 Ćc yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử . 33

2.9.3 Ćc kiểu lai phân tử . 34

viii

2.9.3.1 Lai trong pha lỏng . 34

2.9.3.2 Lai trên pha rắn 34

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP 36

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khóa luận . 36

3.2 Vật liệu và phương ph́p nghiên cứu 36

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm . 36

3.2.1.1 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp . 36

3.2.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 37

3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 37

3.2.2 Ćc thiết bị, dụng cụ thường sử dụng 39

3.3 Phương ph́p nghiên cứu . 39

3.3.1 Phương ph́p triparental mating tiếp hợp đoạn gen gfp vào

vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 39

3.3.2 Ly trích genomic DNA từ ćc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đã

tiếp hợp 40

3.3.3 Phương ph́p Dot Blot 41

3.3.3.1 Chuyển DNA lên màng . 41

3.3.3.2 Phương ph́p ly trích DNA plasmid sử dụng

SDS_kiềm 42

3.3.3.3 Thực hiện đ́nh dấu đoạn DNA plasmid pUT-gfp . 43

3.3.3.4 Thực hiện phản ứng lai 44

3.3.3.5 Ph́t hiện kết quả trên phim X - ray 45

3.3.4 Quan śt vi khuẩn trên kính hiển vi 46

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

4.1 Kết quả . 47

4.1.1 Kết quả tiếp hợp đoạn gen gfp vào vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens . 47

4.1.1.1 Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường LB 47

4.1.1.2 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường KB 47

ix

4.1.1.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường M9 . 48

4.1.1.4 Kết quả làm đối chứng 49

4.1.2 Kết quả ly trích genomic DNA từ ćc dòng vi khuẩn

Pseudomonasfluorescens đã tiếp hợp . 50

4.1.3 Kết quả thực hiên phản ứng lai . 51

4.1.4 Kết quả xem trên kính hiển vi ph́t huỳnh quang

Olympus BX51 53

4.2 Thảo luận . 55

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

5.1 Kết luận . 61

5.2 Đề nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 62

PHỤ LỤC 6