MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN IV

TÓM TẮT KHÓA LUẬN .V

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT IX

DANH SÁCH CÁC BẢNG X

DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ XI

Chương 1. MỞ ĐẦU .1

1.1.ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2.MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI .2

Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME .3

2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3

2.1.2. Định nghĩa về enzyme .4

2.1.3. Cấu tạo phân tử .4

2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại .6

2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 6

2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM .8

2.2.1. Giới thiệu về tôm .8

2.2.2. Khái quát protease 10

2.2.2.1. Định nghĩa protease .10

2.2.2.2. Protease của tôm 11

2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nước và ngoài nước 12

a). Nghiên cứu trong nước 12

b). Nghiên cứu ngoài nước 13

2.2.3. Ứng dụng của protease .14

2.3. PHưƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN

CỨU 15

2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme 15

2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme .16

2.3.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel .18

2.3.3.1. Bản chất của phương pháp .18

2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel 20

a). Chọn lựa gel .20

b). Chuẩn bị gel và bảo quản .20

2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu .20

a). Dựng cột lọc gel .20

b). Chuẩn bị mẫu .21

2.3.3.4. Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel 21

2.3.3.5. ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel 22

a). ưu điểm 22

b). Nhược điểm .22

2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LưỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE .22

2.5. PHưƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME .24

2.5.1. Phương pháp Biuret 24

2.5.2. Phương pháp Lowry 25

2.5.3. Phương pháp Bradford .25

2.5.4. Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) 26

2.5.5. Phương pháp đo phổ .26

Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 27

3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU .27

3.2.1. Vật liệu 27

3.2.2. Hóa chất 28

3.2.3. Thiết bị 28

3.3. CÁC PHưƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG 29

3.4. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú .29

3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease 29

3.4.3. Bố trí thí nghiệm 30

3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu

tôm sú thích hợp 31

3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC 32

3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của CPT .33

a). Nhiệt độ 33

b). pH .33

c). Nồng độ muối ăn 34

3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel .35

3.4.5. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 35

3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu .35

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36

4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME .36

4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau .36

4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác

nhau .38

4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác

nhau .39

4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác

nhau .41

4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp .42

4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC .44

4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau .44

4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau .46

4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH ) SO ở các nồng độ muối bão hòa khác

4 2 4

nhau .47

4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân .49

4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HưỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH

PROTEASE CỦA CPT .51

4.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội

tạng tôm sú 51

4.3.2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú

.52

4.3.3. Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội

tạng tôm sú 53

4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL 55

4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LưỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE 59

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

5.1. KẾT LUẬN 64

5.2. ĐỀ NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC .1

Phụ lục chương 3 69

1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 1

2. Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano 3

3. Phương pháp sắc ký lọc gel 7

4. Điện di SDS-PAGE .9

a). Chuẩn bị hộp điện di 9

b). Chuẩn bị mẫu protein .10

c). Đưa mẫu vào các giếng 10

Phụ lục chương 4 80

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang

Bảng 2.1. Nội dung các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme

. 24

Bảng 4.5. Hàm lượng protein và hoạt tính protease từ DC của các dung môi của

mẫu nội tạng và đầu 42

Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lượng

protease của CPT . 49

Bảng 4.14. Hoạt tính riênng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của enyzme

protease sau sắc ký lọc gel 58

Bảng 4.16. Trọng lượng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE 62

Bảng 4.17. Trọng lượng phân tử protein mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE . 62

DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình Trang

Hình 2.1. Tôm sú . 9

Hình 2.2. Công thức cấu tạo protease . 10

Hình 2.3. Nguyên tắc hoạt động của sắc ký 17

Hình 2.4. Tách các phân tử bằng lọc gel . 18

Hình 2.5. Sắc ký lọc gel loại muối 21

Hình 2.6. Công thức cấu tạo chất màu Coomassie. 26

Hình 3.1. Mẫu nội tạng và đầu tôm sú 27

Hình 4.1. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa

cồn từ DC mẫu nội tạng 55

Hình 4.2. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa

cồn từ DC mẫu đầu tôm 55

Hình 4.3. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa

acetone từ DC mẫu nội tạng 56

Hình 4.4. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa

acetone từ DC mẫu đầu tôm . 56

Hình 4.5. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối

(NH ) SO từ DC mẫu nội tạng . 57

4 2 4

Hình 4.6. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa

muối (NH ) SO từ DC mẫu đầu . 57

4 2 4

Hình 4.7. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu nội tạng 60

Hình 4.8. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu đầu 60

Đồ Thị

Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng tỷ lệ (NT/nước cất) đến hoạt tính protease và hàm lượng

protein của DC nội tạng 36

Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ (đầu /nước cất) đến hoạt tính protease và hàm lượng

protein của DC đầu tôm sú 37

Đồ thị 4.3. Ảnh hưởng tỷ lệ (NT/nước muối sinh lý) đến hoạt tính protease

và hàm lượng protein của DC nội tạng . 38

Đồ thị 4.4. Ảnh hưởng tỷ lệ (đầu/nước muối sinh lý) đến hoạt tính protease

và hàm lượng protein của DC đầu 38

Đồ thị 4.5. Ảnh hưởng tỷ lệ (NT/đệm phosphate) đến hoạt tính protease

và hàm lượng protein của DC nội tạng 39

Đồ thị 4.6. Ảnh hưởng tỷ lệ (đầu/đệm phosphate) đến hoạt tính protease

và hàm lượng protein của DC đầu 4