PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay với sự phát triển như vũ bão của khoa học công nghệ, đặc biệt trong đó công nghệ sinh học là lĩnh vực đã đạt được những thành quả quan trọng và hứa hẹn đem lại những lợi ích vô cùng to lớn trong tương lai cho con người. Các nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào việc chuyển gen để tăng năng suất cây trồng, tạo ra những giống mới có tính năng vượt trội. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thường gặp khó khăn lớn về số lượng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt động của gen, sự biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, người ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lượng lớn để tiến hành nghiên cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen

chúng ta quan tâm thường chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không thể sử dụng các phương pháp sinh hoá thông thường để phân lập gen mục tiêu trên bộ gen. Những vấn đề trên có thể được giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phương tiện mang gen, biến nạp gen, tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ thường được chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp được phân lập để lưu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu được số lượng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu. Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về kĩ thuật di truyền được tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α” phát triển từ đề tài: “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” do Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trường đại học Nông Lâm TPHCM thực hiện.

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn . i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các hình . vii

Danh sách các bảng . ix

PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề . 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện . 2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

2.1 Hiện tương biến nạp ở vi khuẩn . 3

2.1.1 Giới thiệu về hiện tượng biến nạp 3

2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tượng biến nạp 3

2.1.3 Cơ chế của hiện tượng biến nạp . 5

2.1.4 Vai trò của hiện tượng biến nạp . 5

2.1.5 Ứng dụng của hiện tượng biến nạp 5

2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp . 6

2.2.1 Khái niệm chung các vector . 6

2.2.2 Plasmid . 7

2.2.2.1 Cấu trúc . 7

2.2.2.2 Tính chất của plasmid 8

2.2.2.3 Phân loại plasmid 8

2.2.3 Phage 9

2.2.4 Chủng chủ E.coli 9

2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp . 10

2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) . 11

iv

2.3.1.1 Hiện tượng giới hạn . 11

2.3.1.2 Tên gọi các RE 11

2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn 12

2.3.1.4 Các RE loại II 12

2.3.2 Các enzym thông dụng khác 15

2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) 15

2.3.2.2 Taq polymerase . 15

2.3.2.3 Terminal transferase 15

2.3.2.4 Các DNase . 15

2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa . 16

2.3.3 Các enzym nối DNA 16

2.3.3.1 E.coli DNA ligase 16

2.3.3.2 T4 DNA ligase . 16

2.4 Các phương pháp sử dụng trong biến nạp 17

2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 17

2.4.1.1 Phương pháp hóa biến nạp 17

2.4.1.2 Phương pháp điện biến nạp . 18

2.4.2 Phương pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp . 18

2.4.3 Chiết tách DNA plasmid 19

2. 5 Điện di (Electrophoresis) . 19

2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nước và ngoài nước 20

2.6.1 Ngoài nước . 20

2.6.2 Trong nước . 21

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp . 22

3.2 Vật liệu nghiên cứu . 22

3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α . 22

3.2.2 pBluescript II SK(+/-) 22

3.2.3 Đoạn DNA . 23

3.3 Dụng cụ và hóa chất . 23

3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm 23

v

3.3.2 Các thiết bị máy móc . 23

3.3.3 Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn 23

3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm . 24

3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm 24

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn . 25

3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn

E.coli DH5α và kiểm tra 26

3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trường LB . 27

3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 27

3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn

E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt

(theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) . 27

3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra . 29

3.4.6.1 Chiết tách plasmid . 29

3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid

(quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) 32

3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose . 32

3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR 33

3.4.7.1 Phương pháp tinh sạch DNA . 33

3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel 33

3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX . 34

3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR . 35

3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn

DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) 36

3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α

khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) 37

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 38

4.2 Tách chiết DNA plasmid 40

4.2.1 Tách chiết DNA plasmid . 40

vi

4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit . 42

4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV . 42

4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII 44

4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA 44

4.4.2 Tinh sạch plasmid 45

4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp 46

4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp . 46

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận . 48

5.2 Kiến nghị 4