TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Đề tài được tiến hành từ ngày 06-02-2006 đến ngày 31-07-2005 tại phòng thí

nghiệm sinh học phân tử của công ty NTL Biotech.

Ở nước ta hiện nay việc sử dụng interferon trong chữa trị các bệnh như ung thư,

các bệnh do virus gây ra đã phổ biến. Nhưng những interferon này chủ yếu được sản

xuất ở nước ngoài với giá rất cao. Do đó chúng tôi thực hiện tổng hợp và tạo dòng gen

interferon alpha 2a.

Kết quả đạt được như sau:

Tổng hợp được gen interferon alpha 2a.

Biến nạp được gen này vào vi khuẩn E. coli Top10 F’.

Kiểm tra được đoạn gen chèn bằng kỹ thuật PCR, enzyme cắt và điện di.

Đưa mẫu giải trình tự và xác định đúng trình tự đoạn gen.

MỤC LỤC

CHưƠNG TRANG

Lời cảm ơn . iii

Tóm tắt khóa luận iv

Mục lục .v

Danh sách các chữ viết tắt .viii

Danh sách các hình ix

PHẦN I. GIỚI THIỆU . 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục đích - yêu cầu 1

1.2.1. Mục đích 1

1.2.2. Yêu cầu 1

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1. Sơ lược về interferon .2

2.1.1. Đặc điểm chung của interferon 2

2.1.2. Đặc điểm interferon alpha 2a .3

2.1.3. Tình hình nghiên cứu .3

2.2. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) .3

2.2.1. Giới thiệu về phản ứng PCR 3

2.2.2. Một số yếu tố tham gia vào phản ứng PCR .4

2.2.2.1. Enzyme DNA polymerase .4

2.2.2.2. Các nucleotide tự do (dNTPs) .4

2.2.2.3. Primer và nhiệt độ lai .5

2.2.2.4. DNA khuôn 5

2.2.2.5. Dung dịch đệm .5

2.2.2.6. Số chu kỳ phản ứng .6

2.2.2.7. Nhiệt độ và pH .6

2.2.3. Tổng hợp gen .6

2.2.4. Ứng dụng của PCR 6

2.3. Kỹ thuật điện di DNA 7

2.4. Hiện tượng biến nạp ở vi khuẩn 7

2.4.1. Hiện tượng biến nạp 7

2.4.2. Vector – công cụ biến nạp .7

2.4.2.1. Plasmid .8

2.4.2.2. Phage 9

2.4.3. Biến nạp nhân tạo ở vi khuẩn . 10

2.4.3.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp 10

2.4.3.2. Chọn lọc tế bào vi khuẩn đã được biến nạp 10

2.4.4. Vai trò ứng dụng . 13

2.5. Tách chiết DNA plasmid 13

2.6. Một số enzyme sử dụng trong biến nạp 13

2.6.1. Enzyme cắt giới hạn . 13

2.6.2. Enzyme nối . 15

2.7. Nguyên tắc đọc trình tự 15

2.7.1. Phương pháp đọc trình tự của Sanger 15

2.7.2. Giải mã trình tự bằng hệ thống tự động . 15

PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP . 16

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài . 16

3.2. Vật liệu . 16

3.2.1. Vật liệu làm thí nghiệm 16

3.2.1.1. Sáu đoạn oligonucleotide và hai primer 16

3.2.1.2. Vi khuẩn E. coli Top10 F’ . 17

3.2.1.3. Plasmid pGEM-T . 17

3.2.2. Dụng cụ thí nghiệm 17

3.2.3. Thiết bị máy móc 18

3.2.4. Hóa chất sử dụng 18

3.3. Phương pháp nghiên cứu 19

3.3.1. Tổng hợp gen IFN-α2a bằng PCR và chạy điện di kiểm tra 19

3.3.1.1. Tổng hợp đoạn gen 19

3.3.1.2. Chạy điện di kiểm tra 20

3.3.2. Tinh sạch DNA từ gel và thực hiện phản ứng A-Tailing cho đoạn DNA 20

3.3.3. Thực hiện phản ứng nối DNA đã được A-Tailing vào plasmid pGEM-T .21

3.3.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp và thực hiện phản ứng biến nạp 22

3.3.5. Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn .23

3.3.6. Quy trình tách plasmid .23

3.3.7. Chạy PCR kiểm tra .23

3.3.8. Thực hiện phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn 24

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .25

4.1. Phản ứng tổng hợp IFN-α2a .25

4.2. Tạo dòng phân tử IFN-α2a .26

4.2.1. Kết quả biến nạp 26

4.2.2. Tách plasmid .26

4.3. Kết quả kiểm tra .27

4.3.1. Kiểm tra PCR .27

4.3.2. Cắt bằng enzyme cắt giới hạn .28

4.4. Kết quả giải trình tự 28

Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .30

5.1. Kết luận .30

5.2. Đề nghị .30

TÀI LIỆU THAM KHẢO .31

PHỤ LỤC 3