MỤC LỤC

Trang

Bảng viết tắt . 1

Danh mục các hình 2

Mở đầu .. 3

Chương 1: Tổng quan tài liệu . 5

1.1. Bệnh tim mạch 5

1.2. Chất hoạt hóa plasminogen.. 5

1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô người 9

1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm

tan máu đông 12

1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô

người 14

1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 18

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 19

2.1.1. Vật liệu .. 19

2.1.2. Hóa chất . 20

2.1.3. Thiết bị 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu .. 20

2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose 20

2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide 21

2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain

Reaction - PCR) . 22

2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế 23

2.2.5. Ghép nối DNA 23

2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng

phương pháp sốc nhiệt 24

2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli 24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli 24

2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid 25

2.2.8. Xác định trình tự gen .. 26

2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli 27

Chương 3: Kết quả và thảo luận 28

3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA 28

3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR. 28

3.1.2. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và

pET21a(+) .. 30

3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme

hạn chế . 30

3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế 31

3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và

pET21a(+) .. 32

3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hóa h-tPA .. 32

3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phương

pháp sốc nhiệt 32

3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá

h-tPA . 33

3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hóa h-tPA . 37

3.2. Biểu hiện gen .. 43

3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp .. 43

3.2.2. Kiểm tra protein bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE .. 43

Kết luận và đề nghị 47

Tài liệu tham khảo . 48

Phụ lục 54

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên người. Giáo sư Paul Berg thuộc trường đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980, là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA- rDNA) vào năm 1972. Kể từ đó đến nay, công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học và các dược phẩm tạo ra nhờ công nghệ rDNA (dược phẩm sinh học) nhằm phục vụ và bảo vệ sức khỏe con người . Trong lĩnh vực nghiên cứu tạo các loại dược phẩm làm tan các cục máu đông để điều trị huyết khối và các rối loạn huyết khối tắc mạch, cuối những năm 1980, thông qua công nghệ rDNA, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tạo ra một số loại dược phẩm sinh học là các protein tái tổ hợp có khả năng làm tan các cục máu đông “đặc hiệu”. Một trong những protein đó, chất hoạt hóa plasminogen mô của người (human tissue plasminogen activator- h-tPA) đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y dược. DNA bổ sung (complementary DNA- cDNA) của gen mã hóa h-tPA đã được phân lập, tạo dòng, biểu hiện ở nhiều loại tế bào như tế bào trứng chuột đồng (Chinese hamster ovary- CHO), tế bào thận chuột chưa trưởng thành và sản xuất dưới dạng dược phẩm tái tổ hợp .

Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dược phẩm bằng công nghệ sinh học đang bắt đầu được tiếp cận. Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô trong vi khuẩn Escherichia coli tiến tới sản xuất dược phẩm sinh học phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã

hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của ngƣời trong vi khuẩn Escherichia coli”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ rDNA để thiết kế vector và biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli nhằm tiến tới sản xuất protein h-tPA tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dược.

3. Nội dung nghiên cứu

- Tạo dòng gen mã hóa h-tPA trong các vector biểu hiện thích hợp.

- Biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli.

4. Những điểm mới của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu nhằm tiến tới ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô của người - một dược phẩm công nghệ sinh học có giá trị hoàn toàn chưa được nghiên cứu và sản xuất ở nước ta.