MỞ ĐẦU

Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất

nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên

trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới

bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các

nước phát triển. Xuất khẩu ròng từ các nước đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ

USD trong năm 2008. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ

quan trọng tại các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng

đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sau hơn 1 năm

gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam đã có một bước tiến nhảy vọt trong

công tác xuất khẩu thủy sản, chỉ trong năm 2007 sản lượng thủy sản cả nước

ước đạt 3,9 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản

phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể. Đến năm

2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nước ta đã vượt ngưỡng 4 tỷ USD.

Một trong các thị trường nhập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam

là Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu,

để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU phải đảm

bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ quan

quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU là

tương đương. (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiểm

tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất

khẩu và EU tương đương nhau. (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chương trình

giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi và giám sát điều kiện đảm bảo

vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. (iv) Đồng thời thủy sản phải

được phân tích các chỉ tiêu theo quy định của EU trước khi xuất khẩu cùng

với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích.

Như vậy, thực hiện chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh

vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là một điều kiện tiên quyết giúp Việt

Nam được phép xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU. Hai nội dung liên

quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là

định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và

phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP – độc tố gây

tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ).

Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có

công thức cấu tạo:

Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù

hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm

soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn

liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine

đối với họ cá thu ngừ ). Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích

để xác định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên

cứu của một số tổ chức khoa học hoặc tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương

pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLC-

UV và LC/MSn

, phương pháp sinh hóa trên chuột

thì hiện nay Việt nam chưa

có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề

nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể

áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với

điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường )

là rất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghiệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan

chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất

khẩu.

Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi

tập trung tìm ra điều kiện phân tích tối ưu trên thiết bị LC-MS/MS hiện có tại

phòng thí nghiệm để “Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP

(Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc

ký lỏng ghép 2 lần khối phổ” và thực hiện phân tích trên một số mẫu nhuyễn

thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam.

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN . 4

1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ .4

1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản 6

1.3. Đại cương về axít domoic (DA) 8

1.3.1. Tính chất hóa lý. .8

1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: 8

1.3.3. Độc tính của DA .9

1.4. Một số phương pháp phân tích DA .9

1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột 10

1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS) 11

1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương

pháp LC-MS/MS trong phân tích DA .12

1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột 12

1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng 12

1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

,

12

1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản .13

1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) 15

1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng 23

1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột 23

1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký .26

1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: 27

1.7.2. Chiết pha rắn SPE: 27

Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài .29

2.2. Mô hình thực nghiệm 29

2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: .29

2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: 29

2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: .30

2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu: .30

2.5. Xác định các thông số tối ưu: 31

2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS .31

2.5.2. Cột: 31

2.5.3. Pha động và chế độ gradient: 32

2.5.4. Dung môi chiết: .32

2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: 32

2.5.6. Tính toán : .33

2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: .33

2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .33

2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp: .34

2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp: 34

2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể. .35

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36

3.1. Xác định các thông số tối ưu: 36

3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS 36

3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. .40

3.1.3. Dung môi chiết: .45

3.2. Khoảng tuyến tính: 47

3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .49

3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: .49

3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể. .51

3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: 52

3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. 54

3.7.1. Phạm vi áp dụng: 54

3.7.2. Nguyên tắc: .54

3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: .54

3.7.4. Chuẩn bị mẫu: .57

3.7.5. Tiến hành thử nghiệm: 58

3.7.6. Đảm bảo chất lượng 60

3.7.7. Tính toán kết quả: .60

KẾT LUẬN 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO . .62

PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN .1

PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU .4

PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH 13

PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ .19

PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ

.BẰNG HPLC –UV 29

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

DA Axít domoic Axít Domoic

DAD Diot Array Detector Đầu dò Diot Array

EU European Liên minh Châu Âu

FA Formic acid Axít Formic

FLD Fluorescence Detector Đầu dò huỳnh quang

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC-MS/MS Liquid Chromatograph

Tandem Mass Spectrometer

Sắc ký lỏng ghép 2 lần

khối phổ

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng

NPLC Normal Phase Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng pha thuận

ND Not detected Không phát hiện

RPLC Reversed Phase Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng pha đảo

SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn

TFA Trifluoroacetic acid Axít Trifluoro axetic

UV Ultra Violet Cực tím

VIS Visible Nhìn thấy

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Diễn giải Trang

Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC .26

Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm 30

Bảng 03. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản 36

Bảng 04. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone 37

Bảng 05. Kết quả khảo sát năng lượng va chạm .38

Bảng 06. Các Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của năng lương va chạm 39

Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1 .40

Bảng 08. Bảng gradient 2 – pha động 1 41

Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2 42

Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2 43

Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2 44

Bảng 12. So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 ppm .47

Bảng 13. Bảng tổng hợp thông số về độ tuyến tính theo các ion: Error! Bookmark

not defined.

Bảng 14. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp 49

Bảng 15. Kết quả phân tích độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. .49

Bảng 16. Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25) . .51

Bảng 17. So sánh kết quả phương pháp HPLC-UV và LC-MS/MS .53

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình Diễn giải Trang

Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng .16

Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp 17

Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm 17

Hình 04. Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo. .18

Hình 05. Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận. .19

Hình 06. Bộ kết nối phun điện tử 20

Hình 07. Bộ ion hóa hóa học .20

Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực 22

Hình 09. Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS 23

Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18. 24

Hình 11. Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất .24

Hình 12. Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký. 25

Hình 14. Mô hình thực nghiệm .29

Hình 15. Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV .37

Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V .38

Hình 17. Cách phân mảnh ion của DA .39

Hình 18. Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV .40

Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1 41

Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1 42

Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2 43

Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2 44

Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2 45

Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 46

Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93 46

Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 .47

Hình 27. Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính .48

Hình 28. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV .53

Hình 29. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV 5